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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-85777
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8577/


Analyse löslicher EGF-Rezeptoren in Humanserum : Tumormarker bei Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle?

Analysis of soluble EGF-Receptors in human sera : Indicator for squamous cell carcinoma of the oral cavity?

Naderi, Moqaddassa

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Basisklassifikation: 44.96
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Weber, Wolfgang (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.06.2017
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 04.07.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Der Rezeptor für den Wachstumsfaktor EGF findet sich als membranständiges Protein auf Zellen vorwiegend epithelialen Ursprungs. Zahlreiche Tumore überexprimieren den EGF-Rezeptor oder produzieren aberrante Produkte des EGFR-Gens. So beschrieb W. Weber bereits 1984 eine lösliche Form (sEGFR_17), welche von bestimmten epithelialen Tumorzellen in großen Mengen sezerniert wird (Science 224, 294-7). Zwischenzeitlich erschienen zahlreiche Berichte über das Vorkommen löslicher EGF-Rezeptoren auch im menschlichen Serum. Publikationen mehrerer Arbeitsgruppen zeigen Vergleiche von Serum-EGFR-Konzentrationen bei Gesunden und Tumorpatienten, allerdings mit sehr unterschiedlichen und widersprüchlichen Ergebnissen. Hier etablierten wir deshalb einen eigenen immunologischen Assay (ELISA), der die Verfügbarkeit von reinem sEGFR-Protein zur Kalibrierung nutzte. Damit zeigen wir leicht aber signifikant erhöhte Serum-Spiegel von löslichem EGFR bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle. Zwar ist die Herkunft der so erfassten EGFR-Formen nicht eindeutig (sekretorisch oder shedding), aber der so gemessene Parameter mag durchaus als statistisch abgesicherter Marker dienen.– Um später testen zu können, ob das nachweislich von bestimmten Tumorzellen sezernierte Genprodukt sEGFR-17 auch bei diesen Patienten vorkommt, wurde ein weiterer Assay entwickelt, welcher mit einem neuen Antikörper ausschließlich sEGFR-17 erfasst – allerdings mit geringerer Empfindlichkeit. Daher wurden alle EGF-bindenden Proteine aus Serum durch Immunaffinitätschromatographie angereichert, durch ELISA gemessen, durch Immunoblot und vor allem Massenspektroskopie identifiziert. Dieses aufwendige Verfahren wurde hier zunächst mit Normalserum etabliert. Sequenz-spezifisch konnte so eindeutig das Vorkommen von EGFR-Protein im Serum nachgewiesen werden, nicht aber das von sEGFR-17 – was aber auch nicht zu erwarten war, wenn man für dieses Protein eine tumor-spezifische Rolle annimmt. Diese Frage wird sich erst beantworten lassen, wenn eine ausreichende Menge von Tumor-Patientenserum zur Verfügung steht, was im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr möglich war. Dann wird sich testen lassen, ob allein der Nachweis von sEGFR_17 mit der hier entwickelten Methode auf das Vorliegen eines Tumors hinweist. Bis dahin sollte aber auch das hier vorgestellte einfache Testverfahren zur Erfassung von löslichem EGFR auf andere Tumore ausgeweitet werden. Die Verfügbarkeit von reinem sEGFR-Protein als Kalibrator wird dabei verlässliche und vergleichbare Ergebnisse gewährleisten.
Kurzfassung auf Englisch: The Receptor of epidermal growth factor is a cell-surface protein and predominantly located on epithelial cells. Numerous tumours overexpress the EGF-receptor or produce aberrant forms of the EGFR-gene. In 1984 W. Weber discovered a soluble isoform which is secreted in high amounts by a epidermoid carcinoma cell line (Science 224, 294-7). Since then numerous studies have reported the presence of soluble forms of EGF receptors in human sera. Comparing samples of healthy and tumor patients, inconsistent and even contradictory results have been published, possibly due to experimental differences. Therefore, we established a new immunological assay (ELISA) which involves an own antibody and, most importantly, takes advantage of the availability of pure sEGFR-protein for calibration. After having validated this assay we show small but significantly higher serum-levels of EGFR in patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity. Although the origin of EGFR protein detected in serum is not clear (secretion or shedding), the parameter measured by this assay may serve as a statistically verified marker.- To address the question whether the particular secretory product sEGFR-17 may be specific for tumor patients we developed another assay using a new antibody directed against the unique C-terminus of this protein. The reduced sensitivity of this assay required higher technical effort: Immune affinity chromatography was used for the separation of EGF binding proteins from serum which then were identified by immunoblot and mass spectroscopy. This complex procedure was established with normal human serum where it provided sequence-specific evidence for the presence of soluble EGFR-protein. sEGFR-17 was not found in these experiments with normal serum – not unexpectedly if a tumor specific role of this isoform hypothesized. This issue can be resolved when adequate amounts of tumor patient sera will be available (which was not the case within the bounds of this study). Then our procedure will allow to test whether the mere detection of sEGFR-17 in serum may indicate the presence of a tumor. Until then the simple ELISA assay of soluble EGFR presented here should be expanded to other tumors. The availability of pure sEGFR as a calibrator protein will ensure reliable and comparable results.

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