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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-86114
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8611/


Untersuchungen zur Rolle des ramRA-Operons bei der Ausprägung multipler Antibiotikaresistenz in Citrobacter-Arten

Anhorn, Alexander

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Basisklassifikation: 42.30 , 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heisig, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 28.07.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Die Häufung von Antibiotikaresistenzen unter Erregern von Infektionskrankheiten stellt heute eine immer größer werdende Bedrohung für den Menschen dar. Dabei sind die zugrundeliegenden Mechanismen der Resistenzbildung häufig das Ergebnis eines mehrstufigen Prozesses, bei dem es zu einer Akkumulation von Resistenzfaktoren kommt. Einer davon kann ein erhöhter Efflux in den Bakterienzellen sein. Dieser erhöhte Efflux wird meist durch eine Veränderung in der Regulation solcher Gene verursacht, die den Efflux steuern. Eines davon ist ramA, welches in den Enterobakterien der Gattung Citrobacter im Fokus dieser Arbeit stand.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals das ramR-romA-ramA Operon speziesübergreifend im Genus Citrobacter beschrieben. Über eine DNA-Sequenzierung konnten die entsprechenden DNA-Bereiche in Stämmen der Spezies C. farmeri, C. sedlaakii und C. werkmanii eindeutig als homolog zu den für Salmonella, Klebsiella und Enterobacter beschriebenen Genen ramR, romA und ramA identifiziert werden. Über multiple Sequenzvergleiche mit den Sequenzen von C. freundii, C. koseri und C. rodentium, die bereits vor dieser Arbeit publizierten waren, konnte festgestellt werden, dass in allen Citrobacter Stämmen die Gene ramR und ramA hoch konserviert sind, jedoch nicht romA, welches einzig in der Spezies C. rodentium nicht vorhanden zu sein schien. Dieses konnte über eine Sequenzierung für einen Laborstamm bestätigt werden. Durch die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz von RamA konnte außerdem eine hohe Homologie mit den Efflux-induzierenden Transkriptionsfaktoren SoxS und Rob sowie insbesondere MarA bestätigt werden.
Weiter wurde untersucht, inwiefern sich durch die Überexpression von ramA aus Citrobacter freundii ein multiple drug resistance (MDR)–Phänotyp induzieren lässt. Diese Untersuchung wurde analog zu den Beschreibungen des ramA Gens in Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes und Salmonella enterica durchgeführt, wobei das ramA Gen auf einem multicopy Plasmid in die zu untersuchenden Zellen eingebracht wurde. Dadurch konnte ein MDR-induzierender Effekt für ramA aus C. freundii bestätigt werden. Weiter konnte über die Verwendung eines Effluxpumpenhemmers gezeigt werden, dass dieser Effekt vom Efflux abhängig ist. Außerdem ließ sich der Effekt durch eine heterologe Expression in andere Enterobakterien-Stämme verschiedener Arten und Gattungen übertragen. Mit den Versuchen wurde, zusammen mit den DNA-Sequenzvergleichen, die Homologie des ramA-Gens in Citrobacter und denen in Salmonella, Klebsiella und Enterobacter abschließend bestätigt.
Um eine erste Vorstellung für eine räumliche Struktur des RamA Proteins zu bekommen, wurde dieses in silico auf Grundlage der publizierten Kristallstruktur von MarA, gebunden an ein 22 bp langes DNA-Fragment, dreidimensional modelliert. Das erzeugte Modell zeigte in der Simulation der Moleküldynamik eine stabile räumliche Struktur in der Interaktion mit der DNA, die über einen Zeitraum von 14 ns erhalten blieb. Somit konnte das Strukturmodell als wahrscheinlich realitätsnah bewertet werden. Die Analyse der Protein-DNA Interaktionen im Modell wies auf eine Beteiligung von lediglich zwei Aminosäuren im N-Terminus und drei Aminosäuren im C Terminus hin, die jeweils in einem Helix-Turn-Helix–Motiv lokalisiert waren und basenspezifische Wechselwirkungen mit der DNA eingingen. Um eine Wechselwirkung exemplarisch an den N-terminalen Positionen zu prüfen, wurde ein Reportergen-Assay entwickelt, der auf der bekannten aktivierenden Wirkung von RamA auf den pacrAB-Promotor basierte. Letzterer wurde auf einem Plasmid an ein Luziferase-Reportergen gekoppelt und die Promotoraktivität bei gleichzeitiger Überexpression von RamA auf einem Plasmid in Citrobacter freundii gemessen. Dabei wurde die Wildtyp Form mit RamA-Varianten verglichen, die Alanininsubstitutionen an den Positionen Tryptophan 37 und Arginin 41 kodierten. Beide Substitutionsvarianten zeigten eine deutlich verminderte Promotoraktivität im Vergleich zum Wildtyp, womit bestätigt werden konnte, dass beide Aminosäuren wie im Modell vorhergesagt, bedeutsam sind für die Funktion des RamA-Proteins als Transkriptionsaktivator. In entsprechenden Modellvarianten konnte dieses in der Simulation der Moleküldynamik insbesondere für die Position Arginin 41 bestätigt werden. Ein Vergleich der Aminosäure-sequenzen von RamA, MarA und SoxS zeigte, dass diese Positionen in der Familie der AraC/XylS Transkriptionsfaktoren hoch konserviert sind, was die Hypothese der essentiellen Bedeutung dieser Aminosäurepositionen für die Etablierung der Funktion als Transkriptionsfaktor weiter untermauerte. In diesen Untersuchungen wurde ebenfalls die hohe Homologie der beiden Transkriptionsfaktoren RamA und MarA deutlich.
Kurzfassung auf Englisch: Antibiotic resistance is a growing threat to humans and the medical treatment of infectious diseases. Pathogens often become resistant through a stepwise process in which different mechanisms accumulate in the genome of one bacterium. A common mechanism is the increased efflux leading to a lowered concentration of antibiotic drugs within the cell. The cells efflux is regulated via a set of genes. The gene ramA encodes the regulator RamA in enterobacteria of the genus Citrobacter.
In this thesis, the set of genes ramR-romA-ramA has been described in species of the genus Citrobacter. Via DNA-sequencing, these genes could be identified in Citrobacter farmeri, C. sedlaakii and C. werkmanii and were shown to be homologues to the genes that had been described in Klebsiella, Enterobacter and Salmonella before. Multiple sequence alignments revealed ramR and romA to be conserved within the named Citrobacter species and also C. koseri, C. freundii and C. rodentium, for which genetic information was already published. The gene romA was present in all analysed strains, but not in C. rodentium. In this study, this was confirmed via DNA-sequencing in a C. rodentium strain. The amino acid sequence of RamA derived from the DNA-sequence of ramA also showed a strong homology with the transcription factors SoxS and Rob, but particularly with MarA, which all three also having an impact on the regulation of the efflux in the cell.
Further the mechanisms with which overexpression of ramA from Citrobacter freundii was capable to induce a multiple drug resistance (mdr)-phenotype were analysed. Analogous to studies that have been published for Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes and Salmonella enterica, the ramA gene was inserted into the cells on a multi copy plasmid. Thus, it could be shown that overexpression of ramA from C. freundii was associated with the development of a mdr-phenotype in the C. freundii strain. Also strains of further Citrobacter species and other enterobacteria developed the mdr-phenotype under heterologous expression. Under usage of an efflux pump inhibitor no mdr-phenotype could be observed, that is indicated by the efflux dependency.
Taken together the results from the DNA-sequence analyses and the ramA-overexpression demonstrated the homology of the ramRA genes in Citrobacter with those described for Klebsiella, Salmonella and Enterobacter.
To gain a first impression of the structure of RamA a three-dimensional model of the transcription factor bound to a 22 bp DNA-fragment was set up in a computational approach. The structure of the model was based on the crystallographic structure information of MarA bound to the DNA-fragment. Molecular dynamics were simulated over a 14 ns time period. The RamA model retained structural integrity throughout the simulation, indicating the model to be close to the actual structure of the protein. The in silico analysis of the protein-DNA-interaction showed two amino acid positions in the N-terminal and three positions in the C-terminal helix-turn-helix domain to be involved in interaction with the DNAs base pairs. To examine the amino acids of the N-terminus in vitro, a reporter gene assay was set up based on the activating effect of RamA on transcription at the pacrAB-promotor. This promotor was linked to the reporter gene luciferase, and its activity was measured during simultaneous plasmid mediated over-expression of ramA in Citrobacter freundii. The wild type form of ramA was compared with variants encoding alanine-substitutions for tryptophan 37 and arginine 41. Both variants showed a considerable reduction of transcription activation at the pacrAB-promotor. This confirmed both amino acids to be critical in establishing the transcription activating properties of the protein. In addition, the simulation of the molecular dynamics of both variants showed a reduced affinity of the N-terminus to the DNA-fragment, which confirmed the experimental observations. A comparison of the amino acid sequences of the transcriptions factors RamA, MarA and SoxS showed that these positions were strictly conserved within these members of the AraC/XylS-transcription factor family. Finally, these findings underlined the close relation of the two transcription factors RamA and MarA.

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