Die Rolle der Dual Leucine-Zipper Kinase (DLK) für die Entwicklung des Diabetes mellitus Typ 2

Abstract

Die Dekompensation der β-Zelle mit Dysfunktion und Verlust der Masse führt zum klinisch apparenten Bild des Diabetes mellitus Typ 2. Bisherige Daten zeigen, dass die strukturell unterschiedlichen Immunsuppressiva Tacrolimus und Ciclosporin durch Hemmung der calcium/calmodulin-abhängigen Phosphatase Calcineurin die Insulingentranskription vermindern und β-Zellpoptose induzieren. Zusätzlich verstärken beide Arzneimittel die Aktivität der Mitogen-aktivierte Protein Kinase Kinase Kinase 12 (DLK, dual leucine zipper kinase). Des Weiteren hemmt DLK die transkriptionelle Aktivität des β-zellprotektiven Transkriptionsfaktors CREB (cAMP response element binding protein). Angesichts der Bedeutung von CREB für die Aufrechterhaltung der β-Zellfunktion und -masse könnte dieser Mechanismus zu der DLK induzierten β-Zellapoptose beitragen. In dieser Arbeit wurde die Regulation der DLK durch Calcineurin untersucht. Mittels in silico Analysen wurden zwei putative Calcineurin-Interaktionsdomänen innerhalb der DLK identifiziert. Mutation von Val-364 zu Ala innerhalb der zweiten Calcineurin-Interaktionsdomäne erhöhte die Phosphorylierung der untergeordneten c-Jun-N-terminale Kinase (JNK) und hemmte die KCl/Forskolin-induzierte CRE/CREB-abhängige Gentranskription in einem stärkeren Ausmaß als DLK Wildtyp. In HIT-Zellen, die mit der DLK V364A Mutante transfiziert wurden, konnte eine Zunahme der nukleären Translokation und β-Zellapoptose im Vergleich zu den mit DLK Wildtyp transfizierten Zellen beobachtet werden. Der Tumornekrosefaktor (TNF)alpha und die Calcineurininhibitoren Ciclosporin, Tacrolimus und Wasserstoffperoxid (ROS) erhöhten die nukleäre Translokation und die Apoptose in den mit DLK Wildtyp transient transfizierten Zellen, während bei den mit DLK V364A transient transfizierten Zellen die nukleäre Translokation und die Apoptose nicht verstärkt werden konnten. Ein Protein-Protein Interaktionsassay mit rekombinant hergestellten DLK und Calcineurin zeigte, dass diese Mutation die Interaktion zwischen Calcineurin und DLK verhinderte. In Anbetracht dessen, dass LxVP eine Calcineurin-Interaktionsdomäne innerhalb der DLK darstellt, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Interaktion von DLK mit Calcineurin über das LPVP-Motiv zu einer Dephosphorylierung und Hemmung der DLK-Aktivität führt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Regulation von DLK in β-Zellen durch prädiabetische Signale zu untersuchen. TNF alpha induzierte die nukleäre Translokation von DLK Wildtyp. In der vorliegenden Arbeit wurde ein funktionelles nukleares Exportsignal (NES, nuclear export signal) innerhalb der DLK identifiziert. Mutation des NES zeigte einen längeren Aufenthalt von DLK im Zellkern und erhöhte somit die Apoptose. Diese Daten zeigen, dass DLK je nach subzellulärer Lokalisation unterschiedliche Funktionen in der Zelle ausübt und somit eine neuartige Regulation der DLK-Aktivität bieten. Für weiterführende Untersuchungen wurden Mäuse generiert, in denen spezifisch in den β-Zellen DLK ausgeschaltet wurde. Diese Mäuse zeigen keine groben phänotypischen Auffälligkeiten und eine normale glucoseinduzierte Insulinsekretion. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass eine β-zellspezifische Hemmung der DLK den β-zellschädigenden Effekt dieser Kinase auf β-Zellmasse und -funktion verhindern und dazu beitragen könnte, die Entwicklung und das Fortschreiten des Diabetes mellitus Typ 2 zu vermeiden.

Decrease in β-cell mass and function are the most important factors for the clinical manifestation of type 2 diabetes mellitus. Previous data show that the structurally distinct immunosuppressive drugs tacrolimus and cyclosporine decrease insulin gene transcription and induce β-cell apoptosis by inhibiting the calcium-calmodulin dependent phosphatase calcineurin. In addition, both drugs enhance the activity of the mitogen-activated protein kinase kinase kinase 12 (DLK, dual leucine zipper kinase). Furthermore, DLK induces β-cell apoptosis by inhibiting the transcriptional activity conferred by the β-cell protective transcription factor cAMP response element binding protein CREB. This mechanism might contribute to β-cell loss. In this thesis, the regulation of DLK by calcineurin was investigated. In silico analysis revealed two putative calcineurin interaction domains within the DLK. Mutation of Val-364 to Ala within the second putative calcineurin interaction domain increased the phosphorylation of the downstream c-Jun N-terminal kinase (JNK) and was more potent to inhibit KCl/Forskolin-induced CRE/CREB dependent gene transcription than DLK wild-type. In HIT cells transfected with the DLK V364A mutant an increase in β-cell apoptosis and nuclear translocation compared to cells transfected with DLK wild-type was observed. The tumor necrosis factor (TNF) alpha and the calcineurin inhibitors cyclosporine, tacrolimus, and hydrogen peroxide (ROS) increased apoptosis and nuclear translocation in DLK wild-type transfected cells, whereas in DLK V364A mutant transfected cells apoptosis and nuclear translocation could not be further stimulated. Consistent with the notion that calcineurin inhibits DLK activity a protein protein interaction assay with recombinantly produced DLK and calcineurin showed that DLK wild-type but not the DLK V364A mutant interacted with calcineurin. Considering that LxVP represents a calcineurin interaction domain, these results suggest that the interaction of DLK with calcineurin via its LPVP motif dephosphorylates and inhibits DLK activity. Another aim of this thesis was to investigate the regulation of DLK in β-cells by prediabetic signals. TNF alpha induced the nuclear translocation of DLK wild-type. In this thesis a functional nuclear export signal (NES) within DLK was additionally identified. Mutation of the NES lead to an extended stay of DLK in the nucleus and thereby increased apoptosis. These data demonstrate that DLK exerts distinct functions, depending on its subcellular localization and thus provide a novel level of regulating DLK action. For further investigations, mice were generated in which DLK was specifically deleted in the β-cells. These mice do not show rough phenotypic abnormalities and a normal glucose-induced insulin secretion. Taken together, this thesis suggests that a specific DLK inhibition can prevent the β-cell damaging kinase effect on β-cell mass and function and could contribute to avoid the development and progression of type 2 diabetes mellitus.