Stable isotope investigations of nitrification in bacterial cultures and in nature

Abstract

Since industrialization, the production and use of reactive nitrogen have increased considerably. The input of ammonium and nitrate from agriculture and intensive animal husbandry leads to eutrophication. This strongly influences the nitrogen cycle in surface waters, which affects for example the symbiotic community and water quality. In this thesis, pure cultures of nitrite-oxidizing bacteria (NOB) and the nitrogen cycle in the Elbe River near Geesthacht were investigated to determine the importance of nitrification, especially. The second chapter deals with the Elbe River flood in June 2013. Heavy rainfalls in the catch-ment area of the Elbe River led to increased discharge and input of nitrate. Simultaneously, phy-toplankton was inhibited and nutrient uptake was strongly reduced. Nitrification continued, which resulted in an exceptional increase of ammonium and nitrite, and isotope analysis was possible. Subsequently, a combined nitrification (22 to 36%) and denitrification (64 to 78%) regime was determined with a box model approach and based on the calculated isotope effect during nitrite decrease. With decreasing discharge, all nutrient concentrations decreased and nitrate isotopes indicated assimilation by recovered phytoplankton. In the third chapter, the nitrite oxidation performed by distinct NOB is investigated. The activity of NOB is characterized by nitrite oxidation kinetics (substrate affinity and maximum nitrite oxida-tion activity). The nitrite oxidation kinetics of four marine NOB (Nitrospina watsonii 347, Nitrospi-ra Ecomares 2.1, Nitrobacter sp. 311, and Nitrococcus mobilis 231) were analysed and compared to non-marine NOB. The substrate affinity and the maximum nitrite oxidation activity of the individual species have a narrow range which can point to a specialization to low substrate concentrations and low fluctuations of the environmental conditions in marine habitats. Further-more, isotope effects of two marine NOB (Nitrospina watsonii 347 and Nitrospira Ecomares 2.1) were analysed. They showed a rare inverse isotope effect of about 10‰, i.e., decreasing isotope values of the substrate with decreasing substrate concentrations. This is comparable to a previ-ous study with Nitrospina marina but significantly smaller than Nitrobacter sp. 355 and Nitrococ-cus mobilis 231. Possible reasons are a different cell structure and the location of the responsible enzyme in Nitrospina and Nitrospira compared to Nitrobacter and Nitrococcus. The investigated NOB are especially represented in oxygen minimum zones. Oxygen minimum zones are hotspots of nitrification and denitrification, and are often in the focus of biogeochemical model calculations. The nitrite oxidation kinetics and isotope effects thus are an important extension of the database. The fourth chapter also deals with the Elbe River at Geesthacht weir. From July 2011 to May 2013, nutrient concentrations and isotopes (δ15N-NO3-, δ18O-NO3-, δ15N-SPM) of water samples were analysed bimonthly and hydrological conditions investigated. In addition, the importance of nitrification in the Elbe River was determined with rate measurements. A pronounced seasonality, but also short-term events like phytoplankton blooms within a season, was observed. In winter, nitrate in the Elbe River was mainly from soil nitrification in the catchment area and the nitrification rates in the river were low. In spring, discharge and nitrate input from the catchment area decreased. Simultaneously, increasing primary production and SPM concentrations fuelled nitrification in the Elbe River due to coupled remineralisation-nitrification, whereas nitrification was an important nitrate source. Furthermore, nutrient concentrations and isotope ratios showed that in spring assimilation exceeded nitrification and a combined assimilation-nitrification-denitrification regime is most likely in summer and autumn. One of the main outcomes of the research is nitrification being an important nitrate source of the Elbe River. Additionally events like floods interrupt the sensitive nitrogen cycle. In the Elbe River different sources and sinks simultaneously occur, whereas the inverse isotope effect of nitrite-oxidation could not be determined. However, to investigate nitrite oxidation in detail, nitrite oxida-tion kinetics and the inverse isotope effect in pure cultures were analysed.

Seit der Industrialisierung sind die Produktion und Nutzung von reaktivem Stickstoff erheblich gestiegen. Der Eintrag von Ammonium und Nitrat aus intensiver Landwirtschaft und Massentier-haltung führt zu Eutrophierung. Hierdurch wird der Stickstoffkreislauf in Oberflächengewässern stark beeinflusst, was u.a. Auswirkungen auf die Lebensgemeinschaft und Wasserqualität hat. In der vorliegenden Arbeit werden Reinkulturen von Nitrit-oxidierenden Bakterien (NOB) und der Stickstoffkreislauf in der Elbe bei Geesthacht untersucht, um insbesondere die Bedeutung der Nitrifikation zu untersuchen. Das zweite Kapitel befasst sich mit der Elbeflut im Juni 2013. Starkregenereignisse im Einzugs-gebiet der Elbe führten u.a. zu erhöhten Abflussraten und Nitrateinträgen. Gleichzeitig war das Phytoplankton gehemmt und die Nährstoffaufnahme stark reduziert. Nitrifikation fand weiterhin statt, was zu einem außergewöhnlichen Anstieg der Ammonium- und Nitrit-Konzentrationen führte und Isotopenanalysen ermöglichte. Bei anschließender Nitrit-Abnahme wurde auf Grund-lage des berechneten Isotopeneffekts und eines Box-Modells eine Kombination aus Nitrifikation (22 bis 36%) und Denitrifikation (64 bis 78%) abgeschätzt. Mit abnehmendem Abfluss sanken alle Nährstoffkonzentrationen und Nitratisotope wiesen auf Phytoplankton-Assimilation hin. Im dritten Kapitel wird die Nitrit-Oxidation, die von bestimmten NOB ausgeführt wird, untersucht. Charakteristisch für die Aktivität der NOB sind Nitrit-Oxidationskinetiken (Substrataffinität und maximale Nitrit-Oxidationsaktivität). Die Nitrit-Oxidationskinetiken von vier marinen NOB (Nitro-spina watsonii 347, Nitrospira Ecomares 2.1, Nitrobacter sp. 311 und Nitrococcus mobilis 231) wurden analysiert und mit nicht-marinen verglichen. Die Substrataffinitäten und maximalen Nitrit-Oxidationsaktivitäten der marinen NOB haben eine relativ kleine Variationsbreite, was auf eine Spezialisierung auf niedrige Substratkonzentrationen und geringe Fluktuationen der Umweltbe-dingungen in marinen Habitaten hinweisen kann. Außerdem wurden die Isotopeneffekte für die Nitrit-Oxidation durch Nitrospina watsonii 347 und Nitrospira Ecomares 2.1 gemessen. Sie zeig-ten einen seltenen inversen Isotopeneffekt von ca. 10‰, d.h. abnehmende Isotopenwerte des Substrates bei abnehmender Substratkonzentration. Dies ist vergleichbar mit einer früheren Studie mit Nitrospina marina, aber signifikant kleiner als Nitrobacter sp. 355 und Nitrococcus mobilis 231. Mögliche Gründe sind der unterschiedliche Zellaufbau und die Lokalisation des ver-antwortlichen Enzymes in Nitrospina und Nitrospira im Gegensatz zu Nitrobacter und Nitrococ-cus. Die hier untersuchten NOB sind insbesondere in Sauerstoffminimumzonen vertreten. Sauerstoffminimumzonen sind Hotspots für Nitrifikation und Denitrifikation und häufig im Fokus von biogeochemischen Modellrechnungen. Die Nitrit-Oxidationskinetiken für marine NOB und die Isotopeneffekte sind daher eine wichtige Erweiterung der Datenbasis. Im vierten Kapitel wurde ebenfalls die Elbe bei Geesthacht untersucht. Von Juli 2011 bis Mai 2013 wurden regelmäßig Wasserproben u.a. zur Bestimmung der Nährstoffkonzentrationen und der Isotope (δ15N-NO3-, δ18O-NO3-, δ15N-SPM) genommen, sowie die hydrologischen Bedingun-gen untersucht. Außerdem wurde die Bedeutung der Nitrifikation in der Elbe mit Ratenmessun-gen bestimmt. Es konnten eine deutliche Saisonalität, aber auch kurzfristige Ereignisse wie Phytoplanktonblüten innerhalb einer Saison identifiziert werden. Im Winter stammte Nitrat hauptsächlich aus Nitrifikation im Einzugsgebiet und Nitrifikationsraten im Fluss waren gering. Im Frühling sanken der Abfluss und der Nitrateintrag aus dem Einzugsgebiet. Gleichzeitig stieg die Primärproduktion und hohe SPM („suspended particulate matter“) Konzentrationen führten zu steigenden Nitrifikationsraten in der Elbe durch gekoppelte Remineralisierung-Nitrifikation, sodass Nitrifikation im Fluss eine wichtige Nitratquelle war. Die Nährstoffkonzentrationen und Nitratisotope zeigten außerdem, dass im Frühling mehr Nitrat assimiliert als nitrifiziert wurde und im Sommer, sowie Herbst eine Kombination aus Assimilation, Nitrifikation und Denitrifikation wahrscheinlich war. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Nitrifikation in der Elbe eine wichtige Nitratquelle ist und dass Extremereignisse wie eine Flut den sensiblen Stickstoffkreislauf erheblich beeinflussen. In der Elbe treten zeitgleich verschiedene Quellen und Senken auf, wodurch der inverse Isotopeneffekt der Nitrit-Oxidation nicht nachgewiesen werden kann. Um die Nitrit-Oxidation detaillierter zu be-stimmen, wurden die Oxidationskinetiken und der inverse Isotopeneffekt und Reinkulturen untersucht.