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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-87481
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8748/


Synthese und Charakterisierung von anti-EpCAM Antikörper-konjugierten Eisenoxid-Nanopartikeln

Synthesis and characterization of anti-EpCAM antibody-conjugated iron oxide nanoparticles

Salmen, Sunhild Christine

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SWD-Schlagwörter: Nanopartikel , Nanomedizin , Nanotechnologie , Polymere , Stabilität , Tumor , Antikörper , Polyethylenglykole
Freie Schlagwörter (Deutsch): Krebsdiagnostik , Eisenoxid , Biofunktionalisierung
Basisklassifikation: 35.61 , 35.50 , 35.10 , 35.62 , 35.23 , 35.79 , 35.18 , 35.28 , 35.25
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Weller, Horst (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.08.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 29.09.2017
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurde die Synthese lang-zirkulierender Eisenoxid-Nanopartikel sowie deren Modifizierung mit einem monoklonalen anti-EpCAM Antikörper untersucht. Diese Partikel könnten vielversprechende Kandidaten für die gezielte in vivo Detektion verschiedener EpCAM hoch exprimierender Tumorentitäten darstellen.

Im ersten Teil der Arbeit wurde die Herstellung sowie umfassende Charakterisierung der Eisenoxid-Nanopartikel vorgestellt.
Durch die thermische Zersetzung eines Metallprecursors in Gegenwart von Ölsäure als Stabilisator konnten Eisenoxid-Nanopartikel mit hoher Qualität hinsichtlich Monodispersität, Uniformität sowie Kristallinität erhalten werden. Die Nanopartikel sind aufgrund der Synthesebedingungen durch eine stabilisierende Ölsäureschicht bedeckt. Im nächsten Schritt wurde die Partikelober-fläche durch Ligandenaustausch mit einem maßgeschneiderten Polyethylenglykol-Liganden modifiziert. Der heterobifunktionelle Ligand konnte durch Endgruppenfunktionalisierung hergestellt werden. Es wurde gezeigt, dass der Ligandenaustausch unter Erhalt einer engen Teilchengrößenverteilung und somit unter Verhinderung von Aggregation der Nanopartikel durchgeführt werden konnte.
In umfangreichen Untersuchungen konnte das Potential der so erhaltenen PEGylierten Eisenoxid-Nanopartikel für biomedizinische Anwendungen demonstriert werden. In in vitro Versuchen konnte gezeigt werden, dass die PEG-beschichteten Eisenoxid-Nanopartikel über einen physiologisch relevanten Konzentrationsbereich keine akute zytotoxische Wirkung zeigen. Weiterhin konnte die hohe kolloidale Stabilität der PEGylierten Partikel unter physiologischen Bedingungen demonstriert werden. Die Partikel weisen eine hohe Stabilität gegen Verdünnung auf und sind über einen breiten pH-Bereich, sowie bei einer im Blutserum gegebenen Ionenstärke stabil. Durch Inkubation in FCS wurde gezeigt, dass eine Proteinadsorption auf der Partikeloberfläche nicht vollständig verhindert werden kann; die Partikel weisen aber eine hohe Stabilität gegen eine Protein-induzierte Aggregation auf. Die hohe kolloidale Stabilität sowie die Biorepulsivität konnten auch in abschließenden in vivo MRT-Untersuchungen zur Blutzirkulation im Tiermodell demonstriert werden. Die Partikel weisen eine lange vaskuläre Zirkulationszeit auf; nach intravenöser Partikelapplikation blieb die Signalintensität im Blut über den untersuchten Zeitraum von 24 Minuten nahezu konstant.

Im zweiten Teil wurde die Biofunktionalisierbarkeit der PEGylierten Eisenoxid-Nanopartikel mit dem anti-EpCAM Antikörper MOC31 untersucht.
Die Bindungsfähigkeit der Biokonjugate an EpCAM wurde in in vitro Experimenten mit einer EpCAM hoch exprimierenden, humanen Kolonkarzinomzelllinie (HT29) untersucht. Im Rahmen dieser Experimente konnte durch Untersuchung des Einflusses der Blockierung von EpCAM-Bindungsstellen eine spezifische Bindung der Konjugate gezeigt werden. In Experimenten mit einer knockdown Kolonkarzinomzelllinie (HT29EpCAMkd) konnte ein Einfluss des EpCAM-Levels auf die spezifische Bindung demonstriert werden. Dies belegt zusätzlich die Spezifität der Biokonjugate für EpCAM.
Zur Untersuchung der Bindungseigenschaften wurden verschiedene analytische Methoden eingesetzt. Die Anwesenheit der Nanopartikel auf der Zelloberfläche konnte erfolgreich mittels MRT-Analytik nachgewiesen werden. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Atomabsorptionsspektroskopie eine geeignete Methode für die in vitro Detektion und Quantifizierung von Zelloberflächen-gebundenen, Eisen-basierten Nanopartikeln darstellt. Durch eine der kovalenten Anbindung an die Nanopartikel vorangehende Radioiodierung des Antikörpers war eine quantitative Erfassung der Nanopartikel-konjugierten Antikörper trotz der geringen Ansatzgrößen der Kopplungsreaktionen möglich. Weiterhin konnte auf diese Weise die biologische Aktivität des MOC31-Antikörpers nach kovalenter Anbindung an die Polymerhülle der Nanopartikel überprüft werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss der Syntheseparameter Aktivierungsreagenz- und Antikörpermenge auf die Bindungsfähigkeit der Biokonjugate an EpCAM untersucht. Zwischen den verschiedenen Konjugaten konnten Unterschiede nachgewiesen werden. Der höchste Anteil an Biokonjugaten, die spezifisch an EpCAM binden, wurde für die Kopplungsprodukte erhalten, bei denen das Aktivierungsreagenz in einem 2.5*10⁶-fachen und der Antikörper in einem 3-fachen Überschuss eingesetzt wurden. Mittels AAS-Analytik konnte gezeigt werden, dass unter diesen optimalen Bedingungen ~ 0.9% der im Zellexperiment eingesetzten Partikel spezifisch an EpCAM binden. Durch Radioiodierung konnte für diese Konjugate eine Kopplungseffizienz von ~ 8% sowie ein prozentualer Anteil an biologisch aktiven Nanopartikel-konjugierten Antikörpern von ~ 9% ermittelt werden. Durch Erhöhung des Antikörperüberschusses konnte zwar die Kopplungseffizienz gesteigert werden (~ 16%); allerdings scheint eine Anbindung mehrerer Antikörper an dasselbe Partikel zu erfolgen. Gleichzeitig nimmt der Anteil biologisch aktiver Nanopartikel-konjugierter Antikörper drastisch ab (~ 2%). Mittels AAS-Analytik wurde gezeigt, dass nur ~ 0.16% der im Zellexperiment zugesetzten Partikel spezifisch an EpCAM binden. Durch die Kombination der AAS-Analytik mit der Radiomarkierung des Antikörpers konnte eine umfassende Charakterisierung der Biokonjugate erreicht werden.

Die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten PEGylierten Eisenoxid-Nanopartikel weisen ein hohes Potential für biomedizinische Anwendungen auf. Die Ergebnisse der Biofunktionalisierung zeigen, dass eine spezifische Markierung von EpCAM hoch exprimierenden Karzinomzellen mit Eisenoxid-Nanopartikeln über MOC31 möglich ist. Eine Optimierung in Hinblick auf das Ausmaß dieser spezifischen Bindung ist jedoch erforderlich.
Kurzfassung auf Englisch: The focus of this work was the synthesis of long-circulating iron oxide nanoparticles as well as their modification with a monoclonal anti-EpCAM antibody. These particles could be promising candidates for the targeted in vivo detection of a variety of different tumor entities with EpCAM overexpression.

In the first chapter of the thesis, iron oxide nanoparticle production and detailed characterization were presented.
The thermal decomposition of a metal precursor in the presence of oleic acid yielded iron oxide nanoparticles with high monodispersity, shape uniformity as well as crystallinity. Due to synthesis conditions, the particles are coated with a stabilizing layer of oleic acid. In the next step the particle surface was modified with a tailor-made polyethylene glycol ligand using a ligand exchange method. The synthesis of the heterobifunctional ligand was achieved by end-group modification. The ligand exchange could be successfully performed: A narrow size distribution and therefore the prevention of particle aggregation were ascertained.
The potential of the PEGylated particles for biomedical applications could be demonstrated by detailed investigations. In in vitro cytotoxicity assays, no acute toxicity of the PEG-coated particles was observed at relevant physiological concentrations. Furthermore, the high colloidal stability of the PEGylated particles under physiological conditions was shown. The particles exhibit excellent stability in high dilution, over a large pH-range and at physiological ionic strength. When incubating the particles with FCS, the results demonstrated that protein adsorption to the particle surface could not be completely prevented; but the particles show a high stability against protein-induced aggregation. In order to investigate the blood circulation time living animal dynamic MRI was employed. The particles are characterized by a long circulation time; after intravenous application of the particles, the signal intensity in the blood remained nearly unchanged over the probed time span of 24 minutes. The MRI measurements confirmed the high colloidal stability and bio-repulsion.


In the second chapter, the biofunctionalization of the PEGylated iron oxide nanoparticles with the anti-EpCAM antibody MOC31 was investigated.
The binding of the bioconjugates to EpCAM was tested in in vitro experiments with the human colon cancer cell line HT29 that highly expresses EpCAM. Blockage of the EpCAM binding sites was used to investigate specific binding. For the conjugates, a specific antigen binding could be demonstrated. In experiments with a knockdown colon cancer cell line (HT29EpCAMkd) the influence of the EpCAM protein level on specific binding was shown. Furthermore, these observations proved the specificity of the conjugates for EpCAM.
The binding properties were investigated by different analytical methods. MRI studies could be successfully used to verify the presence of the particles on the cell surface. Additionally, it was possible to show that the atom absorption spectroscopy is suitable for in vitro detection and quantification of iron-based nanoparticles bound to cell surface. Radio-labeling of the antibody before conjugation allowed quantitative analysis of nanoparticle-conjugated antibodies despite the small batch sizes. Furthermore, through the use of the radioactive label it was possible to verify the biological activity of the antibody after the coupling.
The effect of the excess of activating agent and antibody on the binding properties of the conjugates was investigated: Different conjugation conditions resulted in differences in the specific binding capacity. Among our experiments, the highest degree of specific binding to EpCAM was obtained with a 2.5*10⁶-fold excess of activating agent and a 3-fold excess of antibody. For these conjugates AAS-analysis revealed a specific binding efficiency of ~ 0.9%. Through radioactive iodination the coupling efficiency was determined to be ~ 8% and the percentage of nanoparticle-conjugated antibodies that preserved their biological activity was determined to be ~ 9%. Increasing the excess of antibody, the coupling efficiency could be improved (~ 16%); however, it seems that these bioconjugates are composed of more than one antibody per nanoparticle. Simultaneously the percentage of antibodies with preservation of their biological activity was significantly reduced (~ 2%). AAS-analysis revealed a specific binding efficiency of just ~ 0.16%. The combination of AAS-analysis with the radio-labeling of the antibody allowed a detailed characterization of the bioconjugates.


The PEGylated iron oxide nanoparticles are promising candidates for biomedical applications. The results of the bioconjugation demonstrated that specific particle labeling of cells with EpCAM overexpression is possible through MOC31. Nevertheless, a significant improvement in efficiency of specific binding is necessary.

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