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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-87898
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8789/


Konstitutive Phosphorylierung von cMyBP-C als Behandlung der Hypertrophischen Kardiomyopathie?

Constitutive phosphorylation of cMyBP-C as a treatment for hypertrohpic cardiomyopathy?

Dutsch, Alexander

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Basisklassifikation: 44.38 , 44.52
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Carrier, Lucie (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.10.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 22.11.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Die hypertrophische Kardiomyopathie (HCM) ist die häufigiste genetisch bedingte kardiale Erkrankung (Prävalenz 1:500), charakterisiert durch eine linksventrikuläre Hypertrophie, eine diastolische Dysfunktion sowie durch eine ungeordnete myokardiale Struktur. Das MYBPC3 Gen ist das am häufigsten betroffene Gen. Die meisten Mutationen führen zu einem frameshift auf mRNA-Ebene und folglich zu einem vorzeitigen Stoppcodon, was zu der Expression von verkürzten oder trunkierten cMyBP-C Proteinen führt. Der Mangel an normalem cMyBP-C Protein bzw. das Vorkommen potenziell schädlicher trunkierter Formen ist grundlegend für die Entstehung der HCM. cMyBP-C ist das Ziel einer Vielzahl von unterschiedlichen Formen der posttranslationalen Modifikation, unter anderem der Phosphorylierung. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem die Phosphorylierung vom Ser-282 im M-Motif des cMyBP-C sich sowohl kardioprotektiv als auch grundsätzlich positiv für die Funktion des Herzens auswirkt.
In der vorliegenden Arbeit sollte der Fokus auf eine Form der molekularen Therapie (Gentherapie) in dem in vitro Modell engineered heart tissue (EHT) gelegt werden. Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit war, ob es einen Unterschied bezüglich der Gentherapie durch Transduktion von KI-EHTs mittels WT cMyBP-C (S282) oder konstitutiv phosphoryliertem cMyBP-C Protein (D282) gibt und welche der Formen geeigneter als Therapie ist.
Kardiale Zellen, für die Generierung von EHTs, wurden sowohl von Mybpc3-knock-in (KI) Mäusen, welche eine beim Menschen häufig auftretende HCM Mutation tragen und von WT Mäusen gewonnen. KI Mäuse zeigen typische Charakteristika der Erkrankung, wie etwa kardiale Hypertrophie sowie eine systolische als auch eine diastolische Dysfunktion.
Eine Behebung des hyperkontraktilen Phänotyps von KI-EHTs (höhere Werte für Kraft sowie Geschwindigkeit von Kontraktion und Relaxation) in den transduzierten EHTs (entweder WT (S282) oder konstitutiv phosphorylierter WT (D282)) war nur unter elektrischer Stimulation (6 Hz) sichtbar (folglich reduzierte Werte für Kraft und Geschwindigkeiten), nicht jedoch bei spontaner Kontraktion der EHTs. Eine leichte Rechtsverschiebung der Sensitivität gegenüber externem [Ca2+] in den D282 EHTs konnte im Vergleich zu den KI-NT beobachtet werden. In den S282 EHTs hingegen war eine komplette Verschiebung bis hin zur WT Sensitivität sichtbar. Sowohl D282, als auch S282 EHTs zeigten einen Kraftzuwachs, wie bereits aus WT Daten zu erwarten, nach der Applikation des β-adrenergen Agonisten Isoprenalin und der calciumsensitivierenden Susbtanz EMD 57033. KI-NT hingegen zeigten einen abgestumpften Effekt nach der Applikation. In D282 und S282 EHTs konnte zudem die Akkumulation von mRNA Mutanten, welche in den KI EHTs/Mäusen zum Tragen kommt, verhindert werden und außerdem die cMyBP-C Proteinmenge der Menge vom WT angeglichen werden. Immunofloureszenzanalysen bestätigten die korrekte Inkorporation der exogenen Proteine in den Sarkomer.
Beide Formen der Therapie waren geeignet die Ausprägung des KI-Phänotyps zu verhindern und diesen somit zu retten. In vitro zeigte sich S282 als der, in den getesteten Bedingungen, dem D282 als überlegen. Um allerdings den Effekt von konstitutiver Phosphorylierung zu bestätigen und weitere Unterschiede zwischen den beiden Therapieformen herauszuarbeiten, sind weitere Studien, v.a. in vivo, unerlässlich. Dafür hat die diese Arbeit den Grundstein gelegt.
Kurzfassung auf Englisch: Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most common inherited disease of the heart (1:500), characterized by a left ventricular hypertrophy, diastolic dysfunction and a disarray of the myocardium. MYBPC3 is the major affected gene. Most of the MYBPC3 mutations lead to a frameshift on mRNA level and result in a premature terminal codon, producing a truncated cMyBP-C protein. The lack of cMyBP-C protein and/or presence of poison polypeptides is thought to be causative for the onset and the progression of HCM. cMyBP-C is a target for many forms of posttranslational modifications, such as phosphorylation. Phosphorylation of Ser-282 in the Mybpc-Motif of the cMyBP-C protein is known to be cardioprotective and beneficial for the function of the heart.
In the present work the focus was set on a molecular therapy (gene therapy) of the disease in the in vitro model of engineered heart tissues (EHTs). The main question to address in this thesis was whether there is a difference in gene therapy of KI-EHTs using either WT cMyBP-C (S282) or constitutively phosphorylated WT cMyBP-C (D282) as a treatment of HCM. Cardiac cells for EHT generation were obtained from both Mybpc3-targeted knock-in (KI) mice, carrying one of the most frequent mutation for HCM found in humans, and WT mice. KI mice display typical features of HCM, such as hypertrophy and both systolic and diastolic dysfunction.
A rescue of the hypercontractile phenotype of KI-EHTs (accelerated contractile parameters (force, velocities of contraction and relaxation)) in the transduced EHTs (using either WT (S282) or constitutively phosphorylated WT (D282)) was only visible under subjection of EHTs to electrical pacing (6 Hz), but not under spontaneous contractions, showing lower forces and velocities of contraction and relaxation. A slight shift towards higher sensitivity for external [Ca2+] was observed in the D282 compared to the KI-NT. A full shift towards WT sensitivity was observed in the S282. D282 and S282 both showed an increase in force, as observed in the WT, according to the application of the β-adrenergic agonist isoprenaline and the calcium sensitizer EMD 57033. Almost no response was seen in the KI-NT only. In both D282 and S282 the accumulation of mutant mRNAs was prevented and cMyBP-C protein levels were restored to WT levels. Immunoflourescence analysis enabled the proof of their proper incorporation into the sarcomere.
Both treatments were able to rescue and to prevent the KI phenotype and restore contractile functions as well as molecular changes. In vitro S282 showed the better outcome and seemed more appropriate for further treatment investigations, however.
But to reveal the effect of constitutive phosphorylation in vivo, further investigations are necessary. The basis was made in this thesis.

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