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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-88514
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8851/


Untersuchung der Wirkung von Luftstrom-induziertem Scherstress auf Alveolarepithelzellen

The effect of airflow related shear stress on alveolar epithelial cells

Brand, Marie Margarete

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SWD-Schlagwörter: Calcium , Reaktive Sauerstoffspezies , Lunge , Luftstrom , NADPH-Oxidase , ARDS , Künstliche Beatmung , Alveolar , Epithel , Fluoreszenzmikroskopie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Alveolarepithelzellen , Scherstress , beatmungsassoziierter Lungenschaden
Freie Schlagwörter (Englisch): alveolar epithelial cells , shear stres , airflow , ventilator-associated lung injury
Basisklassifikation: 44.66
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kiefmann, Rainer (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.09.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 29.11.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Der beatmungsassoziierte Lungenschaden (Ventilator-associated lung injury, VALI) ist eine schwerwiegende Komplikation bei Intensivpatienten. Als Ursache wird ein durch mechanischen Stress initiierter Entzündungsprozess der Alveolen diskutiert. In zahlreichen experimentellen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass Alveolarepithelzellen (AEC) auf mechanische Reize, wie z.B. Dehnung, mit einer Signaltransduktion reagieren, die über zytosolisches Calcium (Ca2+) und mitochondriale reaktive Sauerstoffspezies (mROS) vermittelt wird. Während der Beatmung wirkt in den Atemwegen bis hin zu den Alveolen ein Luftstrom-induzierter Scherstress, über dessen Wirkung noch wenig bekannt ist. Ziel dieser Arbeit war daher die erstmalige Untersuchung einer Mechanorezeption und -transduktion von Luftstrom-induziertem Scherstress in AEC. Die Funktion der epithelialen Glykokalyx als potentiell mechanosensitive Struktur und Veränderungen des Aktinzytoskeletts nach Luftstromexposition wurden überprüft.

Kultivierte AEC (Zelllinie L2) wurden entweder nach Färbung mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 zur Messung der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]zyt) oder nach Transfektion mit dem redoxsensitiven genetischen Fluoreszenzmarker roGFP zur Messung der mROS-Produktion in einer speziellen Luftstromkammer einer laminaren, periodischen Luftströmung ausgesetzt (7,2 mPa Scherstress). Die Messung der [Ca2+]zyt oder der mROS-Produktion erfolgte kontinuierlich mittels Epifluoreszenzmikroskopie. Zur weiteren Untersuchung des [Ca2+]zyt-Signals wurden AEC vor Versuchsbeginn u.a. im Ca2+-freien Medium, mit ROS-modifizierenden Substanzen oder mit Glykokalyx-degradierenden Enzymen inkubiert oder die ROS-produzierende NADPH-Oxidase 4 (NOX4) herunterreguliert. Außerdem erfolgte nach 60-minütiger Luftstromexposition eine Immunfluoreszenz (IF)-Färbung der F-Aktinfilamente der AEC.

Während der Luftstromexposition kam es zu einer Zunahme der mittleren [Ca2+]zyt-Oszillationsamplitude gegenüber Ausgangsbedingungen (Delta A [Ca2+]zyt) um (5,3 ± 0,9) nM bzw. (40,9 ± 8,5) % (p < 0,05). Unter extrazellulären Ca2+-freien Be¬dingungen oder nach Inkubation mit DPI war Delta A [Ca2+]zyt inhibiert. Die Inkubation der AEC mit Antioxidantien wie Acetylcystein, PEG-Katalase oder Superoxiddismutase beeinflusste das Luftstrom-induzierte Ca2+-Signal kaum. Nach siRNA-vermittelter Herunterregulierung der NADPH-Oxidase 4, Inkubation mit dem NO-Synthase Inhibitor L-NAME oder mit Pneumokokken kam es zu einer signifikanten Zunahme von Delta A [Ca2+]zyt während Luftstromexposition. Die enzymatische Degradierung der Glykokalyx ergab widersprüchliche Ergebnisse. Die Änderung der roGFP-Fluoreszenzintensitätsratio pro Zeitintervall als Ausdruck der mROS-Produktion stieg während Luftstromexposition signifikant an. Im Vergleich zur Kontrollbedingung waren die Aktinfilamente in AEC nach Luftstromexposition verdichtet und es wurden vermehrt Stressfasern sichtbar.

Die Ergebnisse zeigen, dass AEC auf Luftstromexposition mit einem spezifischen Ca2+-Signal und einer mROS-Produktion im Sinne einer Mechanotransduktion reagierten. Da unter Ca2+-freien Bedingungen das Luftstrom-induzierte Ca2+-Signal ausblieb, kann davon ausgegangen werden, dass dieses durch einen Ca2+-Einstrom aus dem Extrazellularraum generiert wird. Extrazelluläre ROS scheinen keinen direkten Einfluss auf Delta A [Ca2+]zyt zu haben. Luftstrom-induzierter Scherstress führte in AEC zu einem Umbau im Aktinfilamentgerüst mit vermehrter Stressfaserbildung, was auf Anpassungsprozesse der AEC deuten könnte. Die Rolle der Glykokalyx als mechanosensitive Sturktur konnte nicht abschließend beurteilt werden. Die Untersuchung des Zusammenhanges zwischen dem [Ca2+]zyt-Signal, der mROS Produktion und den Aktinfilamentveränderungen sowie die Frage, inwieweit diese Mechanotransduktionsprozesse zur Pathogenese des VALI beitragen, werden Gegenstand weiterer Forschung sein.
Kurzfassung auf Englisch: Ventilator-associated lung injury (VALI) is a serious problem in critical ill patients. An inflammatory process of the alveoli initiated by mechanical stress is discussed as a major cause. In many experimental studies, it has already been shown that alveolar epithelial cells (AEC) applied to mechanical stimuli, e.g. strain, react with a signal transduction mediated via cytosolic calcium (Ca2+) and mitochondrial reactive oxygen species (mROS). During breathing, air flow-induced shear stress acts in the respiratory tracts up to the alveoli but the effect of it is still little known. The aim of this thesis was therefore to study the mechanoreception and -transduction of airflow-induced shear stress in AEC. The function of the epithelial glycocalyx as a po¬tentially mechanosensitive structure and alterations of the actin cytoskeleton after air flow exposure were examined.

Cultivated AEC (cell line L2) were detected either after staining with the Ca2+-sensitive fluorescent dye Fura-2 for measuring the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]cyt) or after transfection with the redox-sensitive genetic fluorescence marker roGFP for measuring the mROS production in a specific airflow chamber, where they were exposed to a laminar, periodic airflow (7.2 mPa Scherstress). The [Ca2+]cyt or mROS production was measured continuously by epifluorescence microscopy. To further investigate the [Ca2+]cyt signal, AEC were measured either in Ca2+-free medium, after incubation with ROS-modifying substances or with glycocalyx-degrading enzymes or after knockdown of the ROS-producing NADPH oxidase 4 (NOX4). In addition, an immunofluorescence (IF) staining of the F-actin filaments of AEC was carried out after air exposure for 60 minutes.

During air flow exposure, the mean [Ca2+]cyt oscillation amplitude was increased by (5.3 ± 0.9) nM and (40.9 ± 8.5) % (delta A [Ca2+]cyt) (p < 0.05). During Ca2+-free conditions or after incubation with DPI, delta A [Ca2+]cyt was inhibited. The incubation of AEC with antioxidants such as acetylcysteine, PEG-catalase or -superoxide dismutase hardly influenced the airflow-induced Ca2+ signal. After siRNA-mediated knockdown of NOX4, incubation with the NO synthase inhibitor L-NAME or with pneumococci, delta A [Ca2+]cyt was significant increased during air flow exposure. The enzymatic degradation of the glycocalyx gave contradictory results. The change in the roGFP fluorescence intensity ratio per time interval as an expression of the mROS production increased significantly during air flow exposure. In comparison to the IF control staining, the actin filaments in AEC were compressed after air flow exposure and stress fibers were exposed.

The results show that AEC responded to airflow exposure with a specific Ca2+ signal and mROS production in the sense of mechanotransduction. Since the airflow-induced Ca2+ signal was excluded under Ca2+-free conditions, it can be assumed that this is generated by a Ca2+ inflow from the extracellular space. Extracellular ROS do not seem to have a direct effect on delta A [Ca2+]cyt. Airflow-induced shear stress resulted in a change in the actin filament framework with increased stress fiber formation in AEC, which might point to adaptation processes of the AEC. The role of glycocalyx as a mechanosensitive structure could not be conclusively assessed. The investigation of the correlation between the [Ca2+]cyt signal, the mROS production and the actin filament changes, as well as the question how these mechano-transduction processes contribute to the pathogenesis of VALI will be analysed in further experiments.

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