Functional Analysis of Cellular STUbLs in the Replication Cycle of Human Adenovirus Type 5

Abstract

HAdV-C5 repräsentiert ein hervorragendes Modellsystem zur Analyse von Virus- Wirts Interaktionswegen. E1B-55K ist ein multifunktionales virales Protein, das zusammen mit dem viralen Protein E4orf6 und zellulären Komponenten, einen wichtigen Faktor für den Abbau antiviraler zellulärer Proteine durch einen E3 Ubiquitin-Ligase Komplex darstellt. Viele zelluläre Zielproteine es viralen E3 Ubiquitin-Ligase Komplexes wurden bereits identifiziert, wie z.B. p53, Mre11, ATRX und SPOC1. Darüber hinaus wurde der zelluläre Transkriptionsfaktor Daxx als Zielprotein eines E1B-55K induzierten Abbauweges identifiziert, der interessanterweise unabhängig von E4orf6 ist. In diesem Zusammenhang wurde vor kurzem eine neue Gruppe von Proteinen beschrieben, die den proteasomalen Abbau von SUMOylierten Proteinen vermitteln und dementspechend als SUMO-targeted Ubiquitin ligases (STUbLs) bezeichnet werden. Zwei zelluläre STUbL Proteine wurden bisher identifiziert: RNF4 und Arkadia. Soweit bekannt, ist die STUbL Aktivität von RNF4 für die Homöostase von zentraler Bedeutung, um die Akkumulation von SUMOylierten Proteinen innerhalb der Zelle nach zellulärem Stress, einschließlich UV-induzierter DNA Schäden zu verhindern. Im Hauptteil dieser Arbeit wurde die Rolle von RNF4 im produktiven Replikationszyklus von HAdV-C5 untersucht. Zuerst konnte die Interaktion zwischen E1B-55K und RNF4 in IPs bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass RNF4 in die Kernmatrix von infizierten Zellen, benachbart zu E1B-55K enthaltenden punktförmigen Aggregaten, lokalisiert wird. Die Ergebnisse RNF4 depletierter Zellen zeigen, dass RNF4 ein positiver Faktor für die lytische Replikation von HAdVC-5 ist. Dagegen weisen Transformationsversuche, auf einen negativen, inhibitorischen Effekt von RNF4 auf die HAdV-C5 E1A/E1B abhängige Transformation primärer Rattenzellen hin. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit Analysen zur Rolle der zellulären STUbL Arkadia während der produktiven HAdV-C5 Infektion. Arkadia wurde, wie auch RNF4, als neuer Interaktionspartner von E1B-55K identifiziert. Zusätzlich konnte eine Reduktion der Arkadia Proteinmengen während der HAdV-C5 Infektion gezeigt werden, was einen HAdV-C5 abhängigen Abbau von Arkadia während der Infektion vermuten lässt. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit erstmalig eine Interaktion zwischen E1B-55K und beiden STUbLs, die im Falle von RNF4 den produktiven Infektionsverlauf von HAdV-C5 fördert. Um die direkte Verbindung zwischen der produktiven Infektion und der zellulären SUMO-abhängigen Ubiquitin-Maschinerie zu verstehen sind noch weitere Experimente notwendig. Allerdings sind die Unterschiede zwischen den zellulären STUbLs RNF4 und Arkadia während der Infektion sehr interessant und werden die Grundlage für weitere wichtige Untersuchungen sein.

Human Adenovirus Type 5 from species C (HAdV-C5) represents a good model system for analyzing virus-host interaction pathways. The HAdV-C5 55 kDa gene product from early region 1B (E1B-55K) is a multifunctional phosphoprotein, which is a main factor for targeting antiviral cellular proteins for proteasomal degradation in cooperation with the viral early region 4 open reading frame 6 protein (E4orf6) and cellular components of a Cullin-5-dependent E3 Ubiquitin ligase. Many studies identified cellular targets of the viral E3 Ubiquitin complex, for example p53, Mre11, ATRX and SPOC1. Interestingly, the cellular transcription factor Daxx was identified as a target of a novel E1B-55K dependent degradation pathway, which is independent of E4orf6. To date, a new RF containing protein group called SUMO- targeted Ubiquitin ligases (STUbL) were recently connected to proteasomal degradation of SUMOylated protein. To date two cellular STUbL proteins have been identified: RNF4 and Arkadia/RNF111. The degradation of SUMOylated proteins via STUbL activity is important to prevent the accumulation of SUMOylated proteins upon high cellular stress, including DNA damage events, oxidative- and chemically- induced stress and cancer development. The main part of this work investigated the role of RNF4 in the productive replication cycle of HAdV-C5. Since some viral factors (Tax from HTLV-1; Rta from EBV) have been described as targets of RNF4, this work unravels the role of RNF4 in the E1B-55K mediated degradation pathway of the PML associated protein Daxx. First, the interaction of E1B-55K and RNF4 could be confirmed in IP analyzes. Furthermore, RNF4 is relocalized in the nuclear matrix of infected cells juxtaposed to E1B-55K containing aggregates. Results of a RNF4 depleted cell line identified RNF4 as a positive factor for HAdV-C5 lytic replication. Interestingly, in transformation assays performed in primary BRK cells a negative effect of RNF4 on E1 region mediated transformation was observed. The second part of this work focused on the cellular STUbL Arkadia during HAdV- C5 infection. Arkadia was identified as a new interaction partner of E1B-55K and a reduced amount of Arkadia could be detected at late time points of infection, which might indicate a HAdV-C5 dependent degradation of Arkadia during infection. In sum, this work revealed a HAdV-C5 dependent interaction with both cellular STUbLs for the establishment of an efficient viral infection. More experiments are needed to understand the direct link between the productive infection and the cellular SUMO dependent Ubiquitin machinery. However, the differences between the cellular STUbLs RNF4 and Arkadia during infection and the involvement of other viral proteins are of strong interest and subject for further investigations.