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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-78031
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/7803/


Darstellung zwitterionischer Liganden zur Biokompatibilisierung von Quantum Dot in Quantum Rods

Steuter, Michaela

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SWD-Schlagwörter: Nanopartikel , Toxizität , Organische Synthese
Freie Schlagwörter (Deutsch): Zwitterionen , Quantum Dot in Quantum Rods , Zellaufnahme
Basisklassifikation: 35.52 , 35.18
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Weller, Horst (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.01.2016
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 27.06.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Das Interesse am Einsatz von Nanopartikeln zu biochemischen oder medizinischen Zwecken ist in den letzten Jahren merklich gestiegen. Quantum Dot in Quantum Rods (QDQRs) erweisen sich in diesem Zusammenhang als besonders vielversprechend für den Einsatz als Fluoreszenzmarker, da sie unter anderem aufgrund ihrer hohen Photolumineszenz-Quantenausbeute (PLQY) und den immensen Extinktionskoeffizienten viele Vorteile gegenüber organischen Farbstoffen, aber auch sphärischen Quantum Dots (QDs) vergleichbarer Größe haben. Die Anwendung von Nanopartikeln in diesen Bereichen erfordert einen hohen Forschungsaufwand und stellt eine große Herausforderung dar. Nach ihrer Synthese sind QDQRs weder wasserlöslich noch biokompatibel, sodass vor allem an das für den Phasentransfer verwendete Ligandensystem hohe Anforderungen gestellt werden. Die Liganden müssen die Nanopartikel vor äußeren Einflüssen des umgebenden Mediums abschirmen und gleichzeitig dafür sorgen, dass Bestandteile der Partikel nicht nach außen gelangen, da die Nanopartikel teilweise aus toxischen Materialien bestehen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues zwitterionisches Ligandensystem mit einer Dithiocarbamat-Ankergruppe für den Phasentransfer von elongierten II-VI-Halbleiternanopartikeln entwickelt. Dabei wurden sowohl Liganden mit zwei unterschiedlichen Kettenlängen als auch ein symmetrischer Ligand mit zwei zwitterionischen Kopfgruppen synthetisiert. Die mehrstufige Synthese der Liganden war einfach durchführbar, wobei die einzelnen Reaktionen in guten bis sehr guten Ausbeuten verliefen. Die Möglichkeit, die Liganden mit einer funktionellen Gruppe zu versehen, konnte beispielhaft an einem Allyl-Derivat gezeigt werden. Der anschließende Phasentransfer wurde in einem zweiphasigen System aus Methanol und n Hexan durchgeführt und hinsichtlich des Ligandenüberschusses optimiert. Durch die Fällung der QDQRs während des Ligandenaustauschs wurden der Phasentransfer sowie die Aufreinigung der Nanopartikel stark vereinfacht. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass im Gegensatz zu vielen in der Literatur beschriebenen Phasentransferreaktionen kein toxisches Tetramethylammoniumhydroxid benötigt wird, was für den Einsatz in der Biochemie vorteilhaft ist. Nach dem Phasentransfer blieben sowohl die Größe als auch die elongierte Form der Partikel erhalten. Im Rahmen der Ligandenaustauschreaktionen konnte weiter gezeigt werden, dass die optischen Eigenschaften der Nanopartikel nicht von der Kettenlänge des Liganden beeinflusst werden. Sowohl die Absorptions- als auch die Emissionsspektren waren leicht blauverschoben und die erhaltenen PLQY lagen in einem Bereich von 10 – 15%. Der Phasentransfer mit dem symmetrischen Liganden war hingegen nicht erfolgreich, was vermutlich auf den erhöhten Platzbedarf des Liganden auf der Nanopartikeloberfläche zurückgeführt werden kann.
In weiteren Experimenten wurde der Einfluss der Länge des Liganden auf die Stabilität der QDQRs in diversen biologisch relevanten Medien und bei pH-Werten zwischen 5,1 und 11,5 untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die QDQRs mit dem kurzkettigen zwitterionischen Liganden insgesamt stabiler waren. Besonders interessant war das Verhalten der QDQRs in Gegenwart von Proteinen. Obwohl zwitterionische Nanopartikel als weitgehend resistent gegen die Bildung einer Proteinkorona beschrieben werden, wurde eine deutliche Erhöhung der Fluoreszenzintensität sowie eine Steigerung der kolloidalen Stabilität der Partikel nach Zugabe von Rinderserumalbumin (BSA) oder fetalem Kälberserum (FCS) beobachtet, was auf eine Wechselwirkung der Nanopartikeloberfläche mit den Proteinen in Lösung schließen lässt.
Im Rahmen von in vitro Zellkulturexperimenten wurde die Eignung der zwitterionischen QDQRs für den Einsatz in der Biochemie oder Medizin untersucht. In Toxizitätsmessungen zeigte sich, dass die QDQRs trotz ihres im Vergleich zu sphärischen QDs deutlich höheren Anteils an Cadmium und dem Fehlen einer passivierenden ZnS-Schale bis zu einer Konzen-tration von 500 nM nicht toxisch auf A549-Zellen wirkten. Dadurch erfüllen die QDQRs eine wichtige Voraussetzung für biochemische Anwendungen. In weiteren Experimenten wurde die Zellaufnahme der QDQRs mit A549-Zellen untersucht, wobei eine deutliche Abhängigkeit der Aufnahme von der Länge des Liganden festgestellt wurde. Während die Aufnahme der QDQRs mit dem kurzkettigen Liganden unter allen experimentellen Bedingungen stattfand, wurden die QDQRs mit dem langkettigen Liganden nur nach langen Inkubationszeiten ohne Zusatz von FCS aufgenommen. Generell können Nanopartikel durch verschiedenste Mechanismen von Zellen aufgenommen werden. Eine detaillierte Studie zur Klärung der Unterschiede bezüglich der Zellaufnahme in vitro war jedoch nicht Gegenstand dieser Arbeit.
Die anschließenden in vivo Studien zur Zellaufnahme zeigten, dass die zwitterionischen QDQRs nach intravenöser Injektion in der Leber akkumulieren. Dabei befanden sich die QDQRs mit dem kurzkettigen Liganden sowohl in Kupffer-Zellen als auch in sinusoidale Leberendothelzellen (LSECs). Im Gegensatz dazu waren die QDQRs mit dem langkettigen Liganden fast ausschließlich in LSECs zu finden. Die erstaunliche Selektivität eröffnet die Möglichkeit, diese QDQRs zur Therapie von Autoimmunkrankheiten, wie zum Beispiel Multipler Sklerose, durch gezielten Transport immunstimulierender Medikamente in LSECs einzusetzen, um die Induktion spezifischer regulatorischer T-Zellen zu stimulieren und dadurch immunoregulatorische Effekte zu vermitteln.
Kurzfassung auf Englisch: The interest in using nanoparticles for biochemical or medical applications has grown noticeably within the last years. In this context Quantum Dot in Quantum Rods (QDQRs) prove to be especially promising for the use as fluorescent markers. They exhibit many advantages over organic dyes and even spherical Quantum Dots (QDs) of comparable size because of their high photoluminescence quantum yield (PLQY) and immense extinction coefficients for example. The biochemical or medical application of nanoparticles requires great research effort and is still representing a major challenge. After their synthesis QDQRs are neither soluble in water nor biocompatible which leads to high demands on the ligand system used for the phase transfer. The ligands need to protect the nanoparticles from external influences of the surrounding medium and simultaneously need to ensure that no components of the partially toxic nanoparticles can diffuse into the external medium.
In this thesis a new zwitterionic ligand system with a dithiocarbamate anchoring group was developed for the phase transfer of elongated II-VI-semiconductor nanoparticles. In this regard, ligands of two different spacer lengths as well as a symmetric ligand with two zwitterionic head groups were synthesized. The multi step synthesis of the ligands was easy to perform with good to excellent yields for each reaction. The possibility for functionalization of the ligands was demonstrated exemplary by the synthesis of an allyl-substituted derivative. The following phase transfer was performed in a biphasic system containing methanol and n hexane and was optimized with regard to the ligand excess. By precipitation of the QDQRs during the ligand exchange reaction the phase transfer and the successive purification of the nanoparticles were greatly facilitated. Moreover, in contrast to many ligand exchange reactions described in literature no toxic tetramethylammonium hydroxide was needed, which is beneficial for the application of nanoparticles in biochemistry. After the phase transfer the size as well as the elongated shape of the QDQRs were well preserved. Furthermore it could be shown, that the optical properties of the nanoparticles were not dependent on the spacer length of the ligands. The absorption as well as the emission spectra were slightly blue-shifted and the resulting PLQY was in the range of 10 – 15%. The phase transfer with the symmetric ligand however, was not successful, which is probably the result of an insufficient surface occupation owed to the increased spatial requirements of the ligand.
In additional experiments the influence of the spacer length of the ligands with regard to the QDQR stability in several biological relevant media as well as at pH values between 5.1 and 11.5 was analyzed. In this context, QDQRs coated with the short chain zwitterionic ligand were more stable in comparison to QDQRs displaying the long chain zwitterionic ligand. Very interesting results were obtained for the QDQR stability in the presence of proteins. Despite the fact, that zwitterionic nanoparticles are described as remarkably resistant to protein corona formation, a major increase in fluorescence intensity and colloidal stability of the zwitterionic QDQRs was observed after addition of bovine serum albumine (BSA) or fetal calf serum (FCS). This suggests an interaction of the nanoparticle surface with the proteins in solution.
In several in vitro cell culture experiments the suitability of the zwitterionic QDQRs for their use in biochemical or medical applications was investigated. Despite of their significantly higher proportion of cadmium in comparison to spherical QDs and the absence of a passivating ZnS shell, the zwitterionic QDQRs showed no signs of toxicity towards A549 cells up to concentrations of 500 nM. Thus, the zwitterionic QDQRs appear to be promising candidates for biochemical applications. In further experiments the cell uptake of QDQRs by A549 cells was investigated. Surprisingly, the spacer length of the ligand induced clear-cut differences in cellular uptake. QDQRs coated with the short chain zwitterionic ligand were internalized by the cells under all experimental conditions. On the other hand, QDQRs with the long chain zwitterionic ligand were only internalized by the cells after long incubation times and in the absence of FCS. In general, cellular uptake of nanoparticles may occur by various biological processes. A detailed study explaining the differences in cellular uptake in vitro was not within the scope of this thesis.
Subsequent in vivo studies showed that the zwitterionic QDQRs accumulated in the liver after intravenous injection. Interestingly, QDQRs coated with the short chain ligand were found in Kupffer cells as well as liver sinusoidal endothelial cells (LSECs), whereas QDQRs coated with the long chain ligand almost exclusively accumulated in LSECs. This remarkable selectivity provides the opportunity to use these QDQRs for the therapy of autoimmune diseases, like Multiple Sclerosis by selective transport of immunostimulatory drugs to the LSECs, in order to induce specific regulatory T-cells and thereby mediating immunoregulatory effects.

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