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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-81685
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/8168/


Identifying molecular keys regulating phenotypic heterogeneity of Stenotrophomonas maltophilia K279a β-lactamase blaL1 and blaL2 gene expression

Identifizierung molekularer Schlüsselregulatoren für die phänotypische Heterogenität der β-Lactamase blaL1 und blaL2 Geneexpression in Stenotrophomonas maltophilia K279a

Abda, Ebrahim Mama

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Freie Schlagwörter (Deutsch): phänotypische Heterogenität , Stenotrophomonas maltophilia K279a , β-Lactamase , Einzelzelle
Freie Schlagwörter (Englisch): Phenotypic heterogeneity , Stenotrophomonas maltophilia K279a , β-lactamase , single cell
Basisklassifikation: 42.30
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Streit, Wolfgang R. (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 27.06.2018
Kurzfassung auf Englisch: The Gram-negative bacterium Stenotrophomonas maltophilia is considered as an emerging pathogen. It is often associated with cystic fibrosis patients but can also be found in any environment soil, plants, water and healthy human individuals. The microorganism carries many genes coding for multiple antibiotic resistance mechanisms. Among these are the two β-lactamase genes blaL1 and blaL2 that are the major weapons to degrade β-lactam antibiotics. Within this thesis, I was especially interested in identifying non-genetic mechanisms interfering with the expression of the two β-lactamase genes. Thereby, I paid special attention to the phenomenon of phenotypic heterogeneous expression of the β-lactamase genes blaL1 and blaL2. Phenotypic heterogeneity is a widely described cell-to-cell variation in bacteria that enables clonal populations to adapt to changing environments including antibiotic therapy. With current antibiotic treatment strategy that bases itself on the traditional minimum inhibitory concentration, a subpopulation of bacteria escapes drug therapy and is implicated in recurrent infections. The underlying mechanism that modulates phenotypic heterogeneity is diverse and needs to be better understood to optimize antibiotic treatment strategies. Thus, the phenotypic responses of S. maltophilia K279a were studied first by exposing bacterial cells with variable levels of ampicillin. In an ampicillin challenged model, S. maltophilia K279a diverges into cellular subpopulations with distinct but reversible morphotypes of small and big colonies. To verify that the colony morphotypes were not caused by current mutations such as SNPs, the genotypes of 24 colony variants were sequenced and a significant number of SNPs and in/dels were identified. Remarkably, these mutations were not primarily associated with the bacterial resistome and also were not located in the genes essential for growth. When the transcriptomes of big and small colony variants that formed after β-lactam treatment and showed reversible phenotypes were assayed, 12 genes were identified as differentially expressed in big versus small colonies. Among the differentially expressed genes, blaL1 and blaL2 were 15.3- and 6.9-fold transcriptionally strongly up-regulated in big colony variant in comparison to cells forming small colonies. In subsequent studies, β-lactamase expression analysis at the single cell level using the promoter fusions blaL1 and blaL2 genes showed high levels of phenotypic heterogeneity in batch cultures. Noteworthy, individual cells within filaments (or aggregates) of exponentially growing cultures displayed an "ON" mode, while adjacent cells were in an "OFF" mode. A detailed statistical analysis of several hundred cells for each time point in a batch culture revealed that the majority of cells (95 %) were in the bla-OFF during 24 hours period. However, after 32 hours, the majority of cells expressed the red fluorescent protein and were in the bla-ON
mode. This response was independent from the presence of ampicillin. Additionally, the addition of sterile-filtered S. maltophilia K279a supernatants strongly altered the levels of phenotypic heterogeneity of blaL2 expression in exponential cultures. This response was highly reproducible and could be quenched by heat treatment of cell-free supernatants, suggesting that a heat-labile but yet unidentified factor involved in modulating heterogeneous blaL2 expression at single cell level. To further uncover possible molecular switches determining heterogeneity, the transcription profiles on a genome wide level were analyzed from cells that grew for 27 hours and 32 hours using RNA-seq. Thereby, the comE homologue smlt1134 and two putative transmembrane efflux genes (smlt2851 and smlt2852) were found to be differentially expressed in homogenously versus heterogeneously blaL2 expressing cells. Overexpression of comE homologue in S. maltophilia K279a reduced the level of cells that were in a blaL2-ON mode to 1 % or lower. However, phenotypic heterogeneity was unaffected by overexpression of multidrug transporter proteins. Therefore, the data implied that the ComE homologue affected heterogeneous blaL2 expression but its effect could be disrupted by unidentified signal molecules released into the medium. Furthermore, in the newly constructed SMK279aΔsmlt3723 (ampR) mutant bacterial cells were unable to grow in the presence of ampicillin indicating that both basal and inducible expression of blaL1 and blaL2 depends on AmpR activatory ligand in S. maltophilia. While basal expression of β-lactamase led to a reduction in colony size, it was still sufficient to overcome antibiotic stress in the cells forming small colonies. Together with whole-genome sequence analyses of different colony morphotypes, the data presented in this study imply that phenotypic heterogeneity of S. maltophilia K279a is a result of mostly non-genetic variations in individual cells involving the gene products of blaL1, blaL2 and comE homologue. Further, phenotypic heterogeneity is the key determinant affecting the expression and the functional outcomes of the β-lactam resistance and diverse genes involved in bacterial virulence, motility and adhesion, and biofilm formation. Altogether these findings indicate that phenotypic heterogeneity is an important non-genetic based property to enhance fitness of S. maltophilia K279a.
Kurzfassung auf Deutsch: Das Gram-negative Bakterium Stenotrophomonas maltophilia ist ein immer häufiger auftretender Erreger von Krankheiten. Es tritt häufig bei Patienten mit zystischer Fibrose auf, wird aber auch in jeder Umgebung wie im Boden, auf Pflanzen, im Wasser und auch in gesunden menschlichen Individuen gefunden. Der Mikroorganismus trägt viele Gene, die für mehrere Antibiotika-Resistenz-Mechanismen kodieren. Hierzu zählen die beiden β-Lactamase-Gene blaL1 und blaL2, die hauptsächlich für den Abbau von β-Lactam-Antibiotika zuständig sind. Im Rahmen dieser Arbeit war vor allem die Identifizierung von nicht genetischen Mechanismen, die die heterogene Expression der beiden β-Lactamase-Gene blaL1 und blaL2 beeinflussen können, von Interesse. Dabei lag besondere Aufmerksamkeit auf dem Phänomen der phänotypischen heterogenen Expression der β-Lactamase-Gene. Phänotypische Heterogenität ist eine häufig beschriebene Zell-zu-Zell-Variation in Bakterien, die es isogenen Population erlaubt, sich an wechselnde Konditionen, einschließlich der Anwesenheit von Antibiotika, anzupassen. Die aktuellen Behandlungsstrategien mit Antibiotika, basierend auf dem alten Modell der minimalen Hemmkonzentration, ermöglichen es Subpopulationen der Bakterien der Behandlung mit Antibiotika zu entkommen und ermöglichen somit wiederkehrende Infektionen. Der zugrundeliegende Mechanismus, welcher die phänotypische Heterogenität reguliert, ist vielfältig und muss besser verstanden werden, um Behandlungsstrategien mit Antibiotika zu optimieren. Diesem Ansatz folgend, wurden die phänotypischen Veränderungen von S. maltophilia untersucht, die durch die Behandlung der Bakterienzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen des Antibiotikums Ampicillin hervorgerufen wurden. Unter dem Einfluss von Ampicillin bilden S. maltophilia Populationen zelluläre Subpopulationen mit unterschiedlichen aber reversiblen Morphotypen von großen und kleinen Kolonien aus. Um sicher zu gehen, dass die unterschiedlichen Morphotypen der Kolonien nicht durch stabile Mutationen wie SNPs verursacht wurden, wurden die Genotypen der 24 Kolonievarianten sequenziert. Es konnte eine bedeutende Anzahl an SNPs wie Insertionen und Deletionen identifiziert werden. Interessanterweise sind diese Mutationen nicht hauptsächlich mit dem bakteriellen Resistom assoziiert. Des Weiteren konnte keine der Mutationen in den für das Wachstum essentiellen Genen nachgewiesen werden. Im Anschluss an die Behandlung mit β-Laktam-Antibiotika wurden Transkriptome der resultierenden großen und kleinen Kolonie-Varianten, welche reversible Phänotypen zeigten, erstellt. Es konnten 12 Gene identifiziert werden, die in den großen und kleinen Kolonien unterschiedlich exprimiert wurden. Unter den unterschiedlich exprimierten Genen waren, im Vergleich zu den kleine Kolonien, die Gene blaL1 und blaL2 in großen Kolonievarianten 15.3- beziehungsweise 6.9-fach transkriptionell hochreguliert. In weiterführenden Untersuchungen zu der Expression von β -Laktamase Genen auf Einzel-Zell-Ebene mit Hilfe von Promoterfusionen der Gene blaL1 und blaL2, konnte eine hohe phänotypische Heterogenität in Batch-Kulturen nachgewiesen werden. Es ist Bemerkenswert, dass sich einzelne Zellen innerhalb von Filamenten (oder Aggregaten) von exponentiell wachsenden Kulturen in einem „ON“ Modus befanden, während benachbarte Zellen im „OFF“ Modus verblieben. Eine detaillierte statistische Analyse von mehreren hundert Zellen zu jedem Zeitpunkt einer Batch-Kultur ergab, dass sich die Mehrheit der Zellen (95 %) während einer Periode von 24 Stunden im blaL2 „OFF“ Modus befand. Nach 32 Stunden jedoch exprimierten die meisten Zellen das Rot-fluoreszierende Protein und wechseltenin den bla „ON“ Modus. Diese Ergebnisse waren unabhängig von der Anwesenheit des Antibiotikums Ampicillin. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass sich durch die Zugabe von steril filtriertem Überstand von S. maltophilia K279a die Ausprägung der phänotypischen Heterogenität der Expression von blaL2 in exponentiellen Kulturen stark veränderte. Die Reaktion war hochgradig reproduzierbar und konnte durch eine Wärmebehandlung des zellfreien Überstandes vor Hinzugabe geblockt werden. Dies deutet auf eine Beteiligung eines hitzesensitiven bislang unbekannten Faktors hin, welcher bei der Modulation der heterogenen Expression des Genes blaL2 auf Einzell-Zell-Ebene beteiligt ist. Um weitere mögliche molekulare Schalter bezüglich der Heterogenität zu entdecken, wurden genomweite Transkriptionsprofile von Zellen nach 27 und 32 Stunden Wachstum mittels RNA-seq analysiert. Hierbei konnte beobachtet werden, dass neben dem comE-homologen Gen smlt134 auch zwei mögliche transmembrane Efflux-Gene (smlt2851 und smlt2852) unterschiedlich exprimiert werden in Zellen, die blaL2 homogen im Vergleich zu heterogen exprimieren.. Überexpression von comE homologen Genen in S. maltophilia K279a reduziert die Anzahl an Zellen, welche sich im blaL2 „ON“ Modus befinden, auf ein Prozent und weniger. Im Gegensatz dazu konnte bei einer Überexpression von Effluxpumpen kein Einfluss auf die phänotypische Heterogenität festgestellt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das comE Homolog einen Einfluss auf die heterogene Expression von blaL2 hat, dieser Effekt aber durch bislang nicht identifizierte Signalmoleküle, die ins Medium hinzugegeben werden, aufgehoben werden kann. Zellen der konstruierten Mutante SMK279aΔsmlt3723 (ampR), welche keine Regulatoren für die Gene blaL1 und blaL2 kodiert, wiesen in mit Ampicillin angereichertem Medium kein Wachstum auf. Dies deutet darauf hin, dass die natürliche sowie die induzierte Expression der Gene blaL1 und blaL2 von aktivierenden Liganden in S. maltophilia abhängen. Obwohl die natürliche Expression von β-Laktamase zu einer Verringerung des Koloniewachstums führte, war es dennoch notwendig den Antibiotikastress in den kleinen Kolonievarianten zu überwinden. Im Zusammenspiel mit den Sequenzanalysen der kompletten 24 Genome von unterschiedlichen Kolonie-Morphotypen, führen die ausgewerteten Daten der Studie zu der Schlussfolgerung, dass die phänotypische Heterogenität bei S. maltophilia aus überwiegend nicht genetischen Variationen in individuellen Zellen unter Beteiligung der Genprodukte von blaL1, blaL2 und comE-Homologen resultiert. Darüber hinaus stellte sich heraus, dass die phänotypische Heterogenität der entscheidende Faktor ist für die Expression und die Funktion der β-Laktam-Resistenz sowie diverser Gene, die an der bakteriellen Virulenz, Motilität, Adhäsion und der Biofilmbildung beteiligt sind. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass phänotypische Heterogenität eine wichtige, nicht genetische Fähigkeit ist, welche die Fitness von S. maltophilia K279a steigert.

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