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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-83429
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/8342/


Zellwandveränderungen durch Modifikationen der (1,3)-β-Glucansynthase (FgGSL1) und Deletion der Serin/ Threonin Proteinkinase gad8 (FgPK1) in Fusarium graminearum

Glöckner, Annemarie

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Basisklassifikation: 42.15 , 42.13 , 42.03
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schäfer, Wilhelm (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 09.07.2018
Kurzfassung auf Deutsch: F. graminearum ist ein Blütenpathogen, das insbesondere kleinkörnige Getreidearten befällt. Die landwirtschaftlichen Folgen eines Befalls sind sowohl quantitative Einbußen, als auch qualitative Verluste, da das Pathogen durch die Sekretion von Mykotoxinen das Erntegut verunreinigt. Aufgrund dessen ist es von größter Bedeutung die Pathogenität von F. graminearum näher zu untersuchen. Während einer Pflanzeninfektion wird der pilzlichen Zellwand, die den ersten Kontakt zum Wirtsorganismus herstellt, eine bedeutende Rolle zugeschrieben. Die strukturgebenden Polysaccharide Chitin und (1,3) β Glucan bilden mit über 90 % die Hauptbestandteile pilzlcher Zellwände. Trotz der essentiellen Bedeutung ist bisher nur wenig über die Biosynthese des (1,3)-β-Glucans und dessen Enzym, der (1,3) β Glucansynthase, bekannt.
In der vorliegenden Dissertation sollte eine biologische Charakterisierung der (1,3) β Glucansynthase FgGSL1 von F. graminearum durchgeführt werden. Um Lokalisationsstudien des Proteins in vivo durchführen zu können, wurden verschiedene fluoreszierende Fusionsproteine generiert und über eine homologe Rekombination in den nativen FgGSL1-Genlokus transformiert. Diese Klonierungsstrategien führten nicht zur erwarteten Fluoreszenz des Zielproteins. Jedoch wiesen die Mutantenstämme morphologische Veränderung, wie eine Reduktion des radialen Wachstums und der Virulenz auf Weizen, auf. Dabei trug die Position des Fluoreszenzproteins, also die N oder C-terminale Fusion, entscheidend zur Ausprägung des Phänotyps bei. Auch das Fluoreszenzprotein an sich schien einen erheblichen Einfluss auf die Morphologie des Pilzes zu haben, da zwischen Mutanten mit N-terminal fusioniertem GFP und mCherry signifikante Unterschiede hinsichtlich der Konidienlänge ermittelt wurden. Aufgrund der Tatsache, dass FgGSL1 die Biosynthese des (1,3)-β-Glucans katalysiert, lag der Verdacht nahe, dass die Modifikation des Proteins zu Zellwandveränderungen führt. Daher wurde eine effiziente Methode zur Zellwandanalyse im Zuge dieser Arbeit etabliert und durchgeführt. Die Auswertung der erhaltenen Daten ergab eine Reduktion des (1,3) β Glucans sowie eine Zunahme an Chitin in den Zellwänden der GSL1 Mutanten verglichen zum Wildtyp. Durch die Klonierung und Transformation eines Komplementationskonstrukts konnten die beschriebenen Phänotypen der Mutantenstämme aufgehoben werden. Dies bestätigt, dass die homolog integrierten FgGSL1-Fusionskonstrukte für die phänotypischen Veränderungen verantwortlich sind.
Im weiteren Verlauf dieser Doktorarbeit sollte eine biologische Charakterisierung der Deletionsmutante ∆pk1 von F. graminearum, insbesondere in Hinblick auf Zellwandveränderungen durchgeführt werden. In dieser Mutante wurde die essentielle Serin/ Threonin Proteinkinase FgPK1 deletiert (durchgeführt von Dr. Christian Voigt), was zu erheblichen Wachstumsdefiziten des Pilzes führte. Die zelluläre Lokalisation dieses Proteins sowie putative Interaktionspartner sind nicht unbekannt und können nur über orthologe Proteinkinasen der Hefe postuliert werden. In mikroskopischen Untersuchungen konnte die spontane Entstehung sowie Lyse von blasenartigen Verdickungen an den Hyphenspitzen identifiziert und dokumentiert werden. Folglich wurde vermutet, dass Veränderungen der Zellwand in diesen speziellen Strukturen vorlagen. Eine anschließende Zellwandanalyse des Pilzmyzels der ∆pk1 ergab einen erhöhten Chitingehalt. Dies korrelierte mit einer signifikant erhöhten Genexpression der Chitinsynthase 3. Ebenso konnte dieser Befund durch die Anwendung von hochauflösenden Mikroskopietechniken (CLSM, TEM, dSTORM) verifiziert werden. Anhand der generierten Ergebnisse bezüglich des strukturellen Zellwandaufbaus, wurde dieser rekonstruiert und in bildgebende, schematische Modelle widergegeben. Folglich konnte eine Anpassung und Erweiterung des allgemein bekannten Modells zum Aufbau pilzlicher Zellwände im Fall von F. graminearum vorgenommen werden.

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