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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-89011
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/8901/


Entwicklung von LC-MS-basierten Metabolomics-Applikationen zur Bestimmung der geographischen Herkunft von Haselnüssen (Corylus avellana)

Development of LC-MS based metabolomics applications for the determination of the geographical origin of hazelnuts (Corylus avellana)

Klockmann, Sven

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SWD-Schlagwörter: Haselnuss , LC-MS , Chemometrie , Herkunft
Freie Schlagwörter (Deutsch): Metabolomics
Basisklassifikation: 35.26 , 35.39
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Fischer, Markus (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 09.01.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Haselnüsse sind ein wichtiges internationales Handelsgut mit einer Weltjahresernte von 713.000 t (2014), wobei die wirtschaftlich relevanten Anbaugebiete über diverse Länder verteilt sind. Der mengenmäßig größte Teil stammt aus der Türkei, gefolgt von Italien, Georgien, USA sowie Aserbaidschan. Es bestehen zum Teil erhebliche Qualitäts- und damit verbunden Preisunterschiede für Haselnüsse aus den verschiedenen Anbauländern, sodass eine Verfälschung von Waren für kriminell motivierte Unternehmer zur Gewinnmaximierung potentiell sinnvoll erscheinen kann. Derzeit existieren jedoch keinerlei analytische Methoden zur Authentizitätsprüfung in Bezug auf die geographische Herkunft von Haselnüssen, sodass Verfälschungen nicht valide detektiert werden können.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte daher die Entwicklung von massenspektrometrischen Metabolomics-Applikationen zur Bestimmung der geographischen Herkunft von Haselnüssen. Zu diesem Zweck wurden 207 authentische Haselnussproben sowie 59 Haselnussproben der Süßwarenindustrie aus den Erntejahren 2014 und 2015 aus wirtschaftlich relevanten Anbauländern akquiriert.
Zu Beginn erfolgte die Entwicklung von non-targeted UPLC-ESI-QTOF-MS Methoden zum hochaufgelösten Screening von Haselnussproben in Bezug auf das polare und unpolare Metabolom. Beim Vergleich verschiedener Methoden erwies sich die Analyse des unpolaren Metaboloms im positiven Ionenmodus als am besten geeignet für die vorliegende Fragestel-lung. Es wurden 20 Markersubstanzen mit hochsignifikanten Unterschieden zwischen den verschiedenen Ländern identifiziert. Dabei handelt es sich um Lipide der Stoffklassen Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylcholine, Diacylglycerole und Triacylglycerole mit unterschiedlichen Fettsäure-Seitenketten sowie γ-Tocopherol.
Auf Basis dieser 20 Markersubstanzen wurde eine targeted HPLC-ESI-QqQ-MS/MS Methode entwickelt, welche die Anforderungen der Routineanalytik in Überwachungs- und Qualitätssi-cherungslaboratorien in hervorragender Weise erfüllt, wodurch eine spätere Implementierung ohne großen Aufwand ermöglicht wird. Eine umfangreiche Validierung gemäß den Richtlinien der FDA und der DIN 32645 belegte die Robustheit und Sensitivität der entwickelten Methode, welche mit einer Gesamtanalysenzeit (inkl. aller notwendigen Aufarbeitungs- und Messprozesse) von ca. 30-40 min für eine high-throughput Analytik im Metabolomics-Bereich besonders geeignet ist.
Abschließend wurden anhand der authentischen Haselnussproben diverse multivariate Datenanalyseverfahren zur Entwicklung von zuverlässigen statistischen Modellen zur Vorhersage des Herkunftslandes unbekannter Proben getestet und evaluiert. Die besten Ergebnisse konnten mit einem Vorhersagemodell mittels Support Vector Machine Classifica-tion erzielt werden, wobei eine Genauigkeit von 100 % erreicht werden konnte. 80 % der Haselnussproben der Süßwarenindustrie konnten auf diese Weise korrekt vorhergesagt werden. Erste Messungen deuteten darüber hinaus darauf hin, dass diese Methode auch auf geröstete Haselnüsse anwendbar ist.
Kurzfassung auf Englisch: Hazelnuts are an important commodity in the international trade with an annual world crop size accounting for about 713.000 t (2014), whereas commercially relevant harvest areas are spread across several countries. The main production is provided by Turkey, followed by Italy, Georgia, USA and Azerbaijan. To some extent, the the quality and consequently, the price for hazelnuts from these countries may vary considerably, affording a potential incentive for some criminal entrepreneurs to adulterate products for profit maximization. However, there are still no existing analytical methods for verifying the authenticity related to the geographical origin of hazelnuts and thus, no data is available.
Hence, this work focussed on the development of mass spectrometric metabolomics applications for the determination of the geographical origin of hazelnuts. For this purpose, 207 authentic hazelnut samples and 59 hazelnut samples for confectionary industry were acquired from harvest years 2014 and 2015 out of commercially relevant countries.
Initially, non-targeted UPLC-ESI-QTOF-MS methods for high-resolution screening of the polar and nonpolar metabolome of hazelnuts were developed. After the assessment of these methods, the analysis of the nonpolar metabolome in positive ion mode emerged to be best suited for the present issue. Overall 20 marker substances comprising highly significant differences between the different countries were determined and structurally identified. They belong to the lipid classes phosphatidylethanolamines, phosphatidylcholines, diacylglycerols and triacyclglycerols containing different fatty acid side chains, as well as γ-tocopherol.
Based on these 20 marker substances, a targeted HPLC-ESI-QqQ-MS/MS method was developed that perfectly meets the requirements of routine analytics in surveillance or quality control laboratories. Therefore, this method could be easily implemented into routine analytics. A comprehensive validation in accordance with guidelines of the FDA and DIN 32645 has proven the robustness, reproducibility and sensitivity of this method. The whole analysis process only lasts about 30-40 min, including all sample preparation and analysis steps and thus, it is perfectly suited for high-throughput analytics.
Based on authentic hazelnut samples, several multivariate data analysis methods for creating reliable statistical models predicting the geographical origin of unknown hazelnut samples were tested and evaluated. Best results could be achieved using support vector machine classification, gaining 100 % accuracy in the training data. Applying this model to the hazelnut samples for confectionary industry, 80 % could be predicted correct. Furthermore, preliminary results indicate a general applicability for roasted hazelnuts, too.

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