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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-89575
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/8957/


Die Rolle der Immuncheckpoint-Liganden Galectin-9, PVR und PVRL-2 im Rahmen der Akuten Myeloischen Leukämie

Role of the immuncheckpoint ligands Galectin-9, PVR and PVRL-2 in acute myeloid leukemia

Klingler, Felix

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SWD-Schlagwörter: Leukämie , Immuntherapie
Basisklassifikation: 44.86
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Fiedler, Walter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.01.2018
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 13.02.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine bösartige Neoplasie des hämatopoetischen Systems. Als Erstlinientherapie findet eine Kombinationschemotherapie Anwendung. Unter dieser Therapie kommt es in zirka 50% der Fälle zu einem Rezidiv. Als Grund hierfür werden residuale Tumorzellen angesehen. Um diese residualen Tumorzellen zu erreichen, nutzen immuntherapeutische Ansätze das körpereigene Immunsystem. Therapeutika, wie BiTE®- (engl. bispecific t-cell engager) und Immuncheckpoint-Antikörper, erleichtern die Aktivierung von Effektorzellen. In der vorliegenden Arbeit sollte die prognostische Relevanz und therapeutische Eignung der Immuncheckpoint-Liganden Galectin-9, PVR und PVRL-2 im Rahmen der AML unter Berücksichtigung von Kombinationseffekten mit einem BiTE® Antikörper untersucht werden.
Die prognostische Relevanz der mittels PCR gemessenen Expression der drei Gene wurde anhand des AMLSG-07/04-Kollektivs untersucht. Hierbei ergab die Analyse, dass eine hohe Galectin-9- Expression ein positiver Prädiktor für das Gesamtüberlebens-, das ereignisfreie Überlebens- und das rückfallfreie Überlebensintervall war. Eine Verzehnfachung der mRNA-Expression ging mit einer Risikoreduktion von zirka 30% für die Endpunkte einher. Für PVR und PVRL-2 bedeutet eine Verzehnfachung der mRNA-Expression eine Risikosteigerung zwischen zirka 50% und zirka 60% für alle Endpunkte und war somit ein negativer Prädiktor.
Im Zellkulturversuch wurde untersucht, ob die Blockade der Immuncheckpoint-Liganden auf AML-Zelllinien zu einer Steigerung der spezifischen Lyse durch Effektorzellen führte. Um zusätzlich Synergismen mit einem CD3-CD33-BiTE® Antikörperkonstrukt zu untersuchen, wurden Parallelansätze mit und ohne BiTE® durchgeführt. Als Messgröße konnte in einem FACS-basierten Analyseverfahren der Anteil toter AML-Zellen unter allen AML-Zellen etabliert werden, sodass ein Vergleich von Ergebnissen verschiedener Versuchstage und verschiedener Zelllinien möglich war. Sowohl die Blockade von Galectin-9 als auch von PVR führte zu einem signifikanten Anstieg der spezifischen Lyse. Ausgehend vom jeweiligen Referenzwert (ohne BiTE® / mit BiTE® alleine) führte die Zugabe eines blockierenden Antikörpers in der Gruppe ohne BiTE® in der Regel zu einem geringeren Anstieg der spezifischen Lyse als in der Gruppe mit BiTE® – der kombinierte Effekt von BiTE® und Immuncheckpoint-Liganden-Antikörper war also größer als die Summe der Einzeleffekte, ein synergistischer Effekt wurde nicht formal belegt. Auch durch die Blockade von PVRL-2 kam es bei der Mehrzahl der untersuchten Zelllinien zu einem signifikanten Anstieg der spezifischen Lyse. Hingegen konnten additive Effekte durch den Einsatz des BiTE® Antikörpers nur bei einigen Zelllinien gezeigt werden. Für die drei verwendeten Antikörper wurde in der Regel kein statistischer Zusammenhang zwischen Konzentration und spezifischer Lyse beobachtet.
Die Funktionen der in dieser Arbeit untersuchten Immuncheckpoint-Moleküle werden aktuell in der Literatur diskutiert. Es sind für Galectin-9, PVR und PVRL-2 sowohl positive als auch negative regulatorische Effekte auf Immunzellen beschrieben.
Die Ergebnisse von Versuchen mit PVR und PVRL-2 unterstützten sowohl durch die PCR-Daten als auch durch die Zellkulturversuche die These, dass die Expression als Nettoeffekt eine Inaktivierung von Effektorzellen begünstigt.
Die Ergebnisse von Galectin-9 unterstützten durch die Überlebensanalyse die These, dass Galectin-9 einen aktiverenden Effekt auf Immunzellen hatte, hingegen sprachen in-vitro-Versuche für eine Inhibition von T-Zellen. Der klinisch beobachte positive Effekt auf das Gesamtüberleben könnte möglicherweise auf der Wirkung von NK Zellen beruhen.
Hängt die Wirkung von PVR und PVRL-2 im Wesentlichen mit der Rezeptor-Liganden-Interaktion zusammen, wird bei Betrachtung der Literatur deutlich, dass der Effekt von Galectin-9 auch in besonderem Maße von dem „Microenvironment“, also der rezeptorpräsentierenden Zelle und anderen Umgebungsfaktoren, abhängt. Die Diskrepanz der Ergebnisse zwischen dem Überleben des AMLSG-Kollektiv und der in-vitro-Versuche könnten mit Unterschieden im Microenvironment zusammenhängen.
Sowohl das Konzept des BiTE® Antikörpers als auch der Immuncheckpoint-Antikörper werden bei anderen Tumorentitäten bereits in klinischen Studien erfolgreich eingesetzt. Die Daten dieser Arbeit lassen vermuten, dass die untersuchten Immuncheckpoint-Liganden Galectin-9, PVR und PVRL-2 ein erfolgsversprechendes therapeutisches Target darstellen. Es zeigen sich außerdem Hinweise, dass eine Kombinationstherapie aus BiTE® Antikörperkonstrukten und Immuncheckpoint-Liganden- Antikörper besser gegen eine AML wirken könnte als die Einzeltherapien.
Zur weiteren Validierung der Ergebnisse dieser Arbeit könnte ein alternativer Ansatz ohne Antikörper gewählt werden. So könnten durch Knock-out der Immuncheckpoint-Liganden-Gene die Hypothese überprüft werden. Weiterhin könnten die Versuche mit primären Patientenproben anstelle der Zelllinien sinnvoll sein. Um allgemeine Aussagen ableiten zu können, sollte ein besonderer Fokus auf das Microenvironment und dessen Unterschied zwischen Patienten gelegt werden.
Kurzfassung auf Englisch: The acute myeloid leukemia is a malignant neoplasia of the hematopoietic system. First-line therapy includes a combination of chemotherapeutic drugs. With this therapy, there is a relapse rate of approximately 50%. Residual malignant cells are likely to be the cause of relapse. Immunotherapeutic approaches make use of the patients own immune system, e.g. BITE®-antibody constructs help immune cells to recognize and kill malignant cells. This research study will determine the influence of the immune checkpoint ligands Galectin-9, PVR and PVRL-2 in regard of the acute myeloid leukemia and will also be looking for additional effects when using the AMG330-BiTE® antibody construct.
The prognostic relevance of Galectin-9, PVR and PVRL-2 was studied within the AMLSG-07/04 cohort using PCR. A high expression of Galectin-9 was a positive predictor regarding the OS, EFS and RFS. In contrast a high expression of PVR and PVRL-2 was a negative predictor for OS, EFS and RFS.
In cell-cultural studies it was investigated whether the antibody-mediated blocking of Galectin-9, PVR and PVRL-2 increased the specific lysis of AML-cell lines and what the effect of using a BITE® antibody might be. Primary endpoint was the amount of dead AML cells in relation to all AML cells which allows to compare different days of investigation and different cell lines.
The blocking of Galectin-9 surface proteins as well as PVR surface proteins lead to a significant increase in specific lysis of AML cells. Considering the two groups (without BITE® / with BITE®) the killing effect was larger in the group using BiTE® antibodies, yet a synergism could not be verified. When blocking PVRL-2 surface proteins by antibodies the specific lysis increased as well but there was no difference between the groups using BiTE® antibodies or no BiTE® antibodies.
A correlation between blocking-antibody concentration and killing effects could not be seen.
Reviewing the literature there is an ongoing discussion about the role of all three immune checkpoint ligands. For Galectin-9, PVR and PVRL-2 there are immune stimulating as well as inhibiting functions described.
Results of PCR and cell cultural experiments for PVR and PVRL-2 suggests that the expression of these two proteins on the surface of malignant cells lead to the inhibition of effector cells. Regarding the results for Galectin-9 the PCR data suggests immune stimulating effects while the the cell cultural data leads to an inhibitory effect of the surface expression of Galectin-9. We attribute these disconfirming results to the difference of the microenvironment in AMLSG cohort and cell culture. The microenvironment is a key point when it comes to discussing the function of Galectin-9 because some immune cells seems to increase the stimulating effect of Galectin-9 while others do not or even inhibit immune effects especially of CD8+ T cells. The function of PVR and PVRL-2 does not seem to be as much dependent of the microenvironment as it is for Galectin-9.
BiTE® antibodies and immune checkpoint blocking antibodies are present in clinical practice today. The results of this study suggest that Galectin-9, PVR and PVRL-2 are an interesting target in AML therapy as well as in the combination with BiTE® antibodies. Further studies, especially with a second “proof-of-principle” are needed to confirm the attributed functions.

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