Investigation of hypothalamic regulatory mechanisms during spontaneous daily torpor and fasting-induced torpor in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus)

Abstract

The physiology of Djungarian hamsters (Phodopus sungorus) is well adapted to cope with harsh seasonal changes of environmental conditions. Triggered by decreasing day length, the Djungarian hamster starts to develop its winter phenotype (reduced bodyweight, molt to winter coat, gonadal regression) in advance of the upcoming winter season. ThesZe winter adaptions serve to reduce energy expenditure in energetically unfavourable times. During winter, the hamsters express spontaneous daily torpor (SDT), which can reduce energy expenditure by up to 65%. SDT is a strictly seasonal as well as circadian controlled state of metabolic depression with severely reduced body temperature. Besides SDT, Djungarian hamsters are able to use fasting-induced torpor (FIT) in times of food scarcity. This type of torpor can occur at any season and time of day and differs in physiological properties such as torpor depth, torpor duration as well as fuel utilization when compared to SDT. The general physiological properties of torpor in this species have been studied intensively over the past decades. Nevertheless, the regulatory mechanisms underlying torpor are insufficiently known to date. The hypothalamus has become object of major interest in the field of torpor research since this brain area is known for its role in regulating food intake, energy homeostasis as well as body temperature and hosts the master circadian clock. In my doctoral thesis I set out to investigate hypothalamic gene expression profiles in Djungarian hamsters during different torpor states (torpor entrance, mid torpor, arousal, post torpor) at particular times (ZT1, ZT4, ZT7, ZT16) to uncover torpor state dependent as well as circadian regulation patterns. Besides investigating hamsters undergoing SDT, also short- and long day adapted hamsters undergoing FIT were included. In the first part of my thesis I conducted a transcriptomic study by using Illumina sequencing. Here, I set out to investigate expression profiles of all hypothalamic transcripts during torpor entrance. Subsequently, identified genes of interest were verified by RT-qPCR considering all four torpor states. The aim of the second study was to analyse the hypothalamic mRNA expression of selected genes by RT-qPCR in hamsters showing SDT and FIT. The investigated genes were related to orexigenic (Agrp, Npy), circadian clock (Bmal1, Per1) and thyroid hormone (Dio2, Mct8) system. This study enabled the direct comparison of gene expression profiles between SDT and FIT to uncover possible differences in molecular control mechanisms. The third study was designed to investigate a possible involvement of insulin, leptin and glucose in torpor expression of both, SDT as well as FIT, by using ELISA to determine serum concentrations. Furthermore, hypothalamic insulin and leptin sensitivity was assessed by relative gene expression analyses of selected gens (OB-Rb, Socs3, Ptpn1). The transcriptomic study showed that within the hypothalamus 181 genes were up- and 103 genes were down regulated during torpor entrance. Within the group of the 20 most strongly up regulated genes a remarkable number of genes coding for structure proteins was found, including five different collagens, Dnah2 and Myo15a. Also the procoagulation factor Vwf was amongst the most strongly up regulated group. We were able to verify up regulated mRNA expression of Dnah2, Myo15a and Vwf by RT-qPCR. During all other investigated time points these genes showed down regulated expression values. This suggests protective molecular adaptions in the hypothalamus, which are specifically induced during torpor initiation, comprising variations in neuronal plasticity, transport of biomolecules and coagulation. The comparison of expression patterns between SDT and FIT showed up regulated mRNA expression of the orexigenic genes Agrp and Npy solely during FIT. During SDT the expression of these two genes remained unaltered. This provides evidence for a balanced energy state of hamsters using SDT, but a negative energy balance of hamsters using FIT. The relative expression analysis of the clock genes Bmal1 and Per1 demonstrated a disturbed circadian rhythmicity during FIT. In contrast, the circadian rhythmicity during SDT remained comparable to those of active hamsters. During both, SDT as well as FIT, Dio2 expression was down regulated, indicating reduced hypothalamic T3 availability during torpor. In summary, this study demonstrates that SDT and FIT may partly be controlled by different regulatory mechanisms. No significant differences were found in circulating insulin, leptin and glucose concentrations over the course of a torpor bout. However, glucose and insulin were slightly down regulated during torpor entrance of SDT and FIT-LD, indicating a possible role of glucose in torpor initiation mechanisms. Insulin and leptin concentrations were slightly decreased during mid torpor of SDT and FIT-SD. This might suggest an involvement of these two hormones in torpor maintenance. Investigation of hypothalamic controlled leptin sensitivity showed down regulated OB-Rb expression during the post torpid state of SDT, whereas in FIT Socs3 mRNA expression was up regulated during the post torpid state. These data imply reduced leptin sensitivity after a day with torpor in winter adapted Djungarian hamsters. Taken together, the results of my thesis provide new insights in molecular mechanisms of torpor regulation in Djungarian hamsters.

Die Physiologie des Dsungarischen Zwerghamsters (Phodopus sungorus) ist bestens darauf ausgerichtet, mit saisonal bedingten, energetisch ungünstigen Herausforderungen zurechtzukommen. Durch Veränderungen in der Tageslänge, werden bereits vor Wintereinbruch Anpassungen an die bevorstehende Jahreszeit eingeleitet (Körpergewichtsreduktion, Fellwechsel, reproduktive Inaktivität), um Energie einzusparen. Während der Wintersaison selbst zeigen Dsungarische Zwerghamster spontanen täglichen Torpor (SDT), durch den der generelle Energieverbrauch um bis zu 65% gesenkt werden kann. Spontaner täglicher Torpor ist ein saisonal und zirkadian kontrollierter hypometaboler Zustand bei dem die Körpertemperatur drastisch herabgesetzt wird. Zusätzlich zu SDT kann diese Spezies in Zeiten von Ressourcenknappheit auch fasten induzierten Torpor (FIT) zeigen. Diese Form des Torpors unterscheidet sich in mehreren Parametern von saisonalem Torpor. So kann FIT zu jeder Jahres- und Tageszeit auftreten und weist Abweichungen in Torpordauer, Torportiefe sowie des genutzten Energiesubstrates auf. Die generellen physiologischen Eigenschaften von Torpor sind bereits vielfach und sehr gut untersucht. Dennoch sind die regulatorischen Mechanismen, die diesem Phänomen zugrunde liegen noch immer weitestgehend unbekannt. Aufgrund seiner regulatorischen Funktionen, die die Kontrolle von Nahrungsaufnahme, der Energiebalance, der Körpertemperatur sowie der zirkadianen Uhr umfassen, wird angenommen dass der Hypothalamus eine Schlüsselrolle bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von Torpor spielt. Im Rahmen meiner Doktorarbeit habe ich Genexpressionsprofile im Hypothalamus während unterschiedlicher Torporstadien (Torporeintritt, tiefe Torporphase, Aufwachphase, post torpide Phase) zu definierten Zeitpunkten (ZT1, ZT4, ZT7, ZT16) im Dsungarischen Zwerghamster untersucht, um torporstadien abhängige sowie zirkadiane Regulationsmuster identifizieren zu können. Zusätzlich zu kurztagadaptierten Hamstern während SDT wurden auch gefastete Langtag- und Kurztagtiere während FIT untersucht. In der Transkriptomstudie, die den ersten Teil meiner Doktorarbeit ausmacht, wurde mit Hilfe der Illumina Sequenzierung das Expressionsprofil aller Transkripte des Hypothalamus während dem Torporeintritt untersucht. Nachfolgend wurden differenziell regulierte Gene unter Berücksichtigung aller Torporstadien mittels RT-qPCR verifiziert. In einer zweiten Studie wurden Genexpressionsanalysen ausgewählter Gene während SDT und FIT mittels RT-qPCR analysiert, die im Zusammenhang mit dem orexigenen System (Agrp, Npy), der zirkadianen Uhr (Bmal1, Per1) und dem Schilddrüsenhormonsystem (Dio2, Mct8) stehen. Dies ermöglichte den direkten Vergleich der Expressionsprofile zwischen SDT und FIT. In der dritten Studie galt es, eine mögliche Beteiligung von Insulin, Leptin und Glucose an der Regulation von SDT und FIT zu prüfen. Hierzu wurden die Serumkonzentrationen dieser drei Komponenten mittel ELISA bestimmt. Zudem wurde die Insulin- und Leptinsensitivität im Hypothalamus durch Bestimmung der relativen mRNA Expression ausgewählter Gene (OB-Rb, Socs3, Ptpn1) untersucht. Bei der Transkriptomstudie zeigte sich, dass während dem Torporeintritt bei SDT insgesamt 181 Gene hoch- und 103 Gene herunterreguliert wurden, wobei innerhalb der 20 am stärksten hochregulierten Gene eine außergewöhnlich hohe Anzahl an Strukturgenen vertreten war. Diese Strukturgene umfassten fünf unterschiedliche Kollagene sowie Dnah2 und Myo15a. Des Weiteren zählte auch der Koagulationsfaktor Vwf zu den am stärksten hochregulierten Genen. Die hochregulierte Expression von Dnah2, Myo15a und Vwf konnte mittels RT-qPCR verifiziert werden, zeigten aber während aller weiteren untersuchten Torporstadien eine Herunterregulation der mRNA Expression. Diese Ergebnisse geben Hinweise für protektive, molekulare Anpassungen im Hypothalamus, die spezifisch für die Torporeintrittsphase sind. Diese Anpassungen umfassen Veränderungen in der neuronalen Plastizität, dem Transport von Biomolekülen und der Koagulation. Der Vergleich von Expressionsprofilen ausgewählter Gene während SDT und FIT zeigte, dass die orexigenen Gene Agrp und Npy einzig während FIT eine erhöhte Expression aufwiesen, wohingegen diese während SDT unbeeinflusst in ihrer Expression blieben. Dies deutet auf eine ausgeglichene Energiebalance der SDT-Gruppe und einen negativen Energiestatus der FIT-Gruppe. Die relative Expressionsanalyse der Uhrengene Bmal1 und Per1 deuten auf eine Phasenverschiebung der zirkadianen Rhythmik während FIT. Bei der SDT-Gruppe ist die Rhythmik der zirkadianen Uhr dagegen weiterhin vergleichbar mit der Rhythmik aktiver Hamster. Sowohl während SDT als auch während FIT war die mRNA Expression von Dio2 herunterreguliert, was auf eine verringerte T3-Verfügbarkeit im Hypothalamus hindeutet. Insgesamt bestätigt diese Studie nur teilweise die Hypothese, dass es sich bei SDT und FIT um zwei Torporformen handelt, die durch unterschiedliche Regulationsmechanismen gesteuert werden. Die Bestimmung der Serumkonzentration von Insulin, Leptin und Glukose zeigte keine statistisch signifikanten Veränderungen in torpiden Hamstern. Nichtsdestotrotz schienen Glucose und Insulin während dem Torporeintritt bei SDT und FIT-LD tendenziell reduziert zu sein. Dies könnte auf eine Beteiligung von Glucose während der Initiierung beider Torporformen deuten. Die Insulin- und Leptinkonzentration war während der tiefen Torporphase in SDT und FIT-SD leicht erniedrigt, was auf eine mögliche Funktion dieser beiden Enzyme bei der Aufrechterhaltung des torpiden Status hindeuten könnte. Die Untersuchung der Leptinsensitivität zeigte ein herrunterreguliertes OB-Rb-Expressionslevel während SDT und ein erhöhtes Socs3-Expressionslevel während FIT-SD in post torpiden Hamstern. Beides weist auf eine herabgesetzte Leptinsensitivität nach einem Tag mit Torpor in winteradaptierten Hamstern. Zusammenfassend liefert diese Arbeit neue Erkenntnisse über molekulare Mechanismen bei der Torporregulation von Dsungarischen Zwerghamstern.