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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-90196
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9019/


Molekulare und funktionale Charakterisierung der ADP-Ribosylierung der IL-2 Rezeptoruntereinheit CD25 und des homophilen Interaktionsmoleküls CD229

Molecular and functional characterization of IL-2 receptor subunit CD25 and homophilic interaction molecule CD229 ADP-ribosylation

MacMillan, Cary

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SWD-Schlagwörter: ADP-Ribosylierung , Antigen CD25
Freie Schlagwörter (Deutsch): CD229 , ART2
Basisklassifikation: 44.45
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Koch-Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.01.2018
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 07.03.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Die ART2.2 ist ein membranständiges Enzym, welches Membranproteine unter Verwendung des Substrates NAD in einer posttranslationalen Reaktion kovalent unter Freisetzung von Nicotinamid ADP-ribosyliert. Zwei Membranproteine, die ADP-ribosyliert werden, sind die Alpha-Untereinheit des trimeren IL-2-Rezeptors CD25 und das homophile Interaktionsmolekül CD229. CD25 ist für die klonale Expansion von Lymphozyten von herausragender Bedeutung. Das Mitglied der Immunglobulin Superfamilie CD229 kommt vor allem auf B- und T-Lymphozyten vor und erfüllt bei der Ausbildung der Immunologischen Synapse bei der Interaktion von Antigen-präsentierender Zelle und T-Zelle eine noch unbekannte Rolle.
Im ersten Teil der Dissertation wurden verschiedene Lymphomzelllinien, konventionelle und regulatorische T-Zellen auf Zielproteine der ART2 untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass CD229 auf fast allen untersuchten Lymphomzelllinien, Yac-1, DC27.10 und EL4-Zellen vorkommt. CD25 hingegen kommt auf Yac-1-Zellen vor. Die ADP-Ribosylierung von CD25 und CD229 wurde auf Yac-1-Zellen sowohl mittels eNAD und Chemolumineszenz als auch mittels 32P-NAD und Autoradiographie nachgewiesen. CD25 und CD229 stellen zudem Ziele der ADP-Ribosylierung auf primären T-Zellen bzw. regulatorischen T-Zellen dar. Dabei zeigt sich, dass CD229 ein Hauptziel der ADP-Ribosylierung ist.
Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde mittels zielgerichteter Mutagenese untersucht, an welchen Argininen msCD229 ADP-ribosyliert wird. Wenigstens eines der Arginine vom Argininpaar RR254 wird ADP-ribosyliert.
Im dritten Teil der Dissertation wurden die extrazellulären Domänen von CD229 als Fusionsproteine mit dem Fc-Teil von IgG1 kloniert und in HEK-293-Zellen exprimiert. Die Fusionsproteine können für weitere funktionelle Versuche bezüglich des Einflusses der ADP-Ribosylierung auf die homophile Interaktion von CD229 genutzt werden. Zudem wurde nachgewiesen, dass die ADP-Ribosylierung von CD25 einen hemmenden Einfluss auf dessen Signalkaskade hat.
Kurzfassung auf Englisch: The membrane anchored ART2 is an extracellular enzyme, which uses NAD as a substrate to covalently ADP-ribosylate membrane proteins on arginine residues in a posttranslational reaction, producing nicotinamide as a byproduct of the reaction. Two known targets of this reaction are CD25, the alpha subunit of the trimeric IL-2 receptor complex and the homophilic interaction molecule CD229. CD25 is of importance for the clonal expansion of activated lymphocytes. As a member of the immunoglobulin superfamily CD229 is expressed mainly on B- and T-lymphocytes and is thought to participate in forming the immunological synapse, the contact area between B-cell and T-cell. CD229 is recruited to the area of contact and interacts homophilically.
In the first part of the dissertation, different lymphoma cell lines were examined for their expression of known ART2-target proteins. CD229 was found on all examined cell lines, i.e. on Yac-1, DC27.10 and EL4 cells. CD25 on the other hand was expressed by Yac-cells. ADP-ribosylation of CD229 and CD25 was confirmed by using 32P-NAD or eNAD in Yac-1 cells. In common T-cells and Tregs CD229 is evidently a primary target of ADP-ribosylation.
The second part of this dissertation explores the arginine residues of msCD229 as potential targets of ADP-ribosylation by means of site-directed mutagenesis. Radioactive assays revealed that at least one of the arginines of the doublett RR254 is ADP-ribosylated.
The third and last part of this dissertation deals with the functional consequences of ADP-ribosylation of CD25 und CD229. ADP-ribosylation of CD25 reduces pSTAT5 levels, thereby having an inhibitory effect on CD25 signal transduction. CD229-Fc fusionproteins were cloned and produced in HEK-293 cells. The fusion proteins can be used for future assays to further asses the effect of the ADP-ribosylation of CD229 on its homophilic interaction.

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