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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-90420
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9042/


Funktionelle Analyse von SHANK3-Mutationen assoziiert mit Synaptopathien

Functional Analysis of SHANK3 mutations associated with synaptopathies

Martens, Victoria Isabel

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SWD-Schlagwörter: SHANK3 , postsynaptische Dichte , Synaptopathie , Autismus-Spektrum-Störungen , Autismus , Asperger , Schizophrenie , Alzheimer , Ras , Protein
Freie Schlagwörter (Deutsch): Zellbiologie , Biochemie , Neurobiologie
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kreienkamp, Hans-Jürgen (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.03.2018
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 07.03.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Synaptopathien sind Erkrankungen des Nervensystems, die auf eine Fehlfunktion der Synapsen zurückzuführen sind. Zu diesen Erkrankungen gehören die Alzheimer´sche Erkrankung, Schizophrenie und Autismus-Spektrum-Störungen. Bisher war das Shank3-Protein vor allem als Strukturprotein in der postsynaptischen Dichte bekannt, welches durch zahlreiche Protein-Protein-Interaktionen eine Vielzahl von Proteinen innerhalb der postsynaptischen Dichte vernetzt und die funktionelle Stabilität der Synapse gewährleistet.

Dieser Arbeit lag die Beobachtung zugrunde, dass es sich darüber hinaus bei der Shank3-SPN-Domäne um eine Ras-assoziierte Domäne handelt, die an Ras-GTPasen bindet. Weiterhin konnte auch gezeigt werden, dass diese Interaktion durch die mit Autismus-Spektrum-Störungen assoziierten Mutationen L68P und R12C gestört wird. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, die funktionelle Bedeutung der Interaktion zwischen Shank3 und Ras-GTPasen aufzuklären und ein besseres Verständnis für die Bedeutung und Funktionalität des N-terminalen Bereichs von Shank3 zu erhalten. Hierbei wurden insbesondere die beiden Ras-GTPasen Ras und Rap untersucht. Bei der Analyse der Interaktion zwischen Shank3 und Ras-GTPasen wurde zunächst festgestellt, dass Shank3- und HRas-Proteine in den dendritischen Dornen angereichert sind, das HRas-Protein jedoch eine breitere Verteilung in der neuronalen Zelle zeigt. Zur spezifischen zellbiologischen Untersuchung der Interaktion von Shank3 und Ras-GTPasen wurde eine bimolekulare Fluoreszenz-Analyse durchgeführt. Es konnte zellbiologisch gezeigt werden, dass sowohl Ras als auch Rap eine Interaktion zu Shank3 eingehen, die konstitutiv aktive HRas-G12V-Mutante eine stärkere Bindung als HRas-WT aufweist und die beiden Shank3-Mutanten Shank3-L68P und Shank3-R12C eine Störung bei der Bindung zu Ras-GTPasen zeigen. Weiterhin wurde zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung der Interaktion von Shank3 und Ras-GTPasen ein effizienter SynGAP-Knockdown-Virus etabliert, der die Proteinmenge an SynGAP drastisch reduziert und in Folge einer Aktivitätssteigerung von Ras in der Synapse zu einer erhöhten Aktivität des MAPK-Signalweges führt. Der generierte Vektor ermöglicht zukünftige Experimente zur Untersuchung von Shank3 als Effektorprotein von Ras-GTPasen. Weiterhin wurde durch Behandlung mit 8-CPT das Rap-GEF Epac2 spezifisch aktiviert und festgestellt, dass dies nicht zu einer Rekrutierung von Shank3 an die Synapse führt. Durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Analyse konnte gezeigt werden, dass die Shank3-SPN-Domäne eine intramolekulare Bindung mit der ARR-Domäne eingeht und diese Bindung bei den beiden Mutanten Shank3-L68P und Shank3-R12C gestört ist. Eine Stimulation der Ras-Aktivität mittels EGF-Behandlung zeigte bei Shank3-WT, aber nicht bei Shank3-L68P und Shank3-R12C-überexprimierenden HEK293T-Zellen in der Lebendzellmikroskopie eine kurzfristige Änderung der Lokalisation von Shank3-Aggregaten. In der Durchflusszytometrie konnte allerdings keine Veränderung der Intensität des FRET-Gesamtsignals im Hinblick auf unterschiedliche Ras-Aktivitäten festgestellt werden; dies lässt vermuten, dass die Shank3-Proteine nach Stimulation durch Ras in ihrer Konformation geöffnet werden und sich unmittelbar danach in einer anderen Konstellation in Shank3-Aggregaten zusammenlagern.

Sowohl die Ras-Proteinmenge in der postsynaptischen Dichte, als auch die Aktivität Ras-vermittelter Signalwege sind im Gehirn Shank3-defizienter Mäuse nicht verändert. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass das Shank1-Protein, welches ebenfalls eine SPN-Domäne besitzt, den Funktionsverlust von Shank3 in hohem Maße kompensieren kann.

Bei der Untersuchung des Neuritenwachstums wurden ebenfalls keine signifikanten Veränderungen bei Überexpression des Shank3-L68P-Proteins festgestellt. Es wurden allerdings erhebliche Unterschiede in der Rap-vermittelten Integrinaktivität festgestellt. So wurde immunhistochemisch gezeigt, dass der Verlust des Shank3-Proteins im frühen pränatalen Entwicklungsstadium (P0,5) zu einer Erhöhung der Menge an Gesamt-Integrinen und aktiven Integrinen führt, während dieser Effekt bei adulten Tieren kaum nachweisbar ist. Bei einer Analyse hippokampaler Neuronen konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Integrinaktivität bei Shank3-WT überexprimierenden Zellen in den Wachstumskegeln geringer als bei Shank3-L68P überexprimierenden Zellen ist. Somit konnte in dieser Arbeit das Shank3-Protein als Negativ-Regulator der Ras-GTPase Rap identifiziert werden, welcher die Integrinaktivierung durch Bindung an aktives, GTP-gebundenes Rap verhindert.
Kurzfassung auf Englisch: Synaptopathies are neurological disorders which are caused by functional defects of the synapse. These synaptic disorders include Alzheimer’s disease, schizophrenia and autism spectrum disorders.

Previous studies have shown that Shank3 is a scaffolding protein at the postsynaptic density which interacts with several proteins within the postsynaptic density and functionally stabilizes the synapse.

This work is based on the observation that the Shank3-SPN domain is a Ras association domain which binds Ras GTPases; the interaction between Shank3 and Ras GTPases is strongly affected by the mutations causing Shank3-L68P and Shank3-R12C mutants, which were found in patients with autism spectrum disorders.

This work aimed to clarify the function of the interaction between Shank3 and Ras GTPases and to investigate the functional role of the N-terminal part of Shank3. Therefore, the focus was on the Ras GTPases Ras and Rap.
To start the analysis of the interaction between Shank3 and Ras GTPases, it was shown via immunocytochemistry that Shank3 and HRas are both localized at the dendritic spines with HRas being more broadly distributed in hippocampal neurons. To specifically analyze the binding between Shank3 and Ras GTPases a bimolecular fluorescence analysis was performed. It was shown in cell-based fluorescence assay that Ras as well as Rap interact with Shank3, that the constitutively active form HRas-G12V binds stronger to Shank3 when compared to HRas-WT and that the mutants Shank3-L68P or Shank3-R12C show impaired binding to Ras GTPases. Furthermore, an efficient SynGAP knockdown virus was established which activates the MAPK signaling pathway via Ras activation. In future experiments this virus can be used to investigate, if Shank3 is an effector protein of Ras GTPases. Additionally, hippocampal neurons were treated with 8-CPT, which specifically activates the Rap GEF Epac2. The localization of Shank3 was not altered at the synapse after Rap activation.

Via Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) analysis it was shown that Shank3-SPN domain binds intramolecularly to the ARR domain and that this binding is impaired in Shank3-L68P or Shank3-R12C mutants. The stimulation of Ras activity via EGF treatment led to changes in the appearance of Shank3-WT, but not Shank3-L68P and Shank3-R12C aggregates within HEK293T cells during live cell imaging. The measurement of the total FRET signal intensity via flow cytometry did not change after treatment. One possible explanation is that the Shank3 conformation opens up after Ras activation and Shank3 proteins form new aggregates immediately thereafter.

The analysis of the Ras protein level and Ras-mediated signaling pathways in Shank3 deficient mice, which have a higher Shank1 protein level compared to wildtype mice, showed no significant differences in Ras protein level within the postsynaptic density or the activity of MAPK and PI3K pathways. These results indicate that the SPN domain-containing Shank1 protein could in parts compensate the functional loss of Shank3.

Upon analysis of neurite growth, I also did observe significant differences in Shank3-L68P overexpressing neurons compared to wildtype.

However, the analysis of Rap-mediated integrin activation showed drastical changes due to the loss of the Shank3-SPN domain functionality. Via immunohistochemistry it was shown that Shank3 deficient mice (P0,5) have a higher level of total integrin and active integrin in cortical brain tissue during early postnatal development - whereas this can be barely detected in adult mice. Further analysis of Shank3-L68P overexpressing neurons show higher integrin activity compared to Shank3-WT in hippocampal neurons. Thus, Shank3 was identified as negative regulator of Ras-GTPase Rap by binding to active GTP-bound Rap protein and inhibiting integrin activity.

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