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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-90462
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9046/


Charakterisierung von Xylanen und Xylanderivaten durch reduktive Aminierung und Flüssigchromatographie

Characterization of xylans and xylan derivatives with reductive amination and liquid chromatography

Lorenz, Dominic

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SWD-Schlagwörter: Chemie , Analyse , Polysaccharide
Freie Schlagwörter (Deutsch): Xylane
Freie Schlagwörter (Englisch): Xylans
Basisklassifikation: 35.23 , 35.07
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Saake, Bodo (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.02.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 29.03.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Für die Analytik von Xylanen und Xylanderivaten sind Verfahren mit komplexen Anforderungen erforderlich. Diese Polysaccharide weisen eine heterogene Zusammen-setzung mit vielfältigen Eigenschaften der einzelnen Komponenten auf. Daher müssen Verbindungen chromatographisch voneinander getrennt werden, die auf der einen Seite große strukturelle Ähnlichkeiten, auf der anderen Seite signifikante Unterschiede hinsichtlich ihrer Ladung und Größe aufweisen. Zudem gibt es für viele Bestandteile, wie beispielsweise 4-O-methyl-α-D-glucopyranosyl Uronsäure (meGlcA) in Methyl¬glucurono¬-xylanen oder die substituierten Monosaccharide der Xylanderivate, keine reinen Standards, die für eine Quantifizierung geeignet sind.
Zum Aufbau einer neuen Methode für die Analytik von Methylglucuronoxylanen wurde zunächst das Verhalten der Polymere während der Hydrolyse mit Schwefelsäure untersucht. Es konnte verdeutlicht werden, dass die α-(1→2)-glycosidische Bindung von meGlcA zur Xylosehauptkette deutlich stärker ist als die β-(1→4)-glycosidische Bindung zwischen den Xylosebausteinen. Mit Intensivierung der Hydrolysebedingungen unterliegen die Bestandteile einem sekundären Abbau, sodass maximal nur zwischen 55 und 64% der meGlcA, verglichen mit den Referenzwerten aus 13C-NMR-Spektroskopie, in der Polymerlösung bestimmt werden können. Die Minimierung des sekundären Abbaus durch mildere Hydrolysebedingungen bewirkt eine partielle Hydrolyse, die den Verbleib von Oligosacchariden mit meGlcA als Bestandteil zur Folge hat. Auch für diese Verbindungen stehen keine reinen Standards zur Verfügung. Um dennoch alle Komponenten quantifizieren zu können, wurden die Kohlenhydrate durch reduktive Aminierung mit 2-Aminobenzoesäure (2-AA) und 2-Picolinboran mit einem UV-Label versehen. Nach Chromatographie mittels HPAEC konnten die markierten Kohlenhydrate durch UV-Detektion mit einem molaren Detektorrespons erfasst und mittels 2-AA-Kalibrierung quantifiziert werden. Durch die zusätzliche Detektion der Oligomere konnten bis zu 9% mehr Xylose und bis zu 85% mehr meGlcA bestimmt werden.
Das Verfahren, bestehend aus reduktiver Aminierung und HPAEC-UV, wurde auf komplexe xylanhaltige Produkte übertragen. Dafür erfolgte zunächst der Vergleich der enzymatischen und sauren Hydrolyse von Zellstoffen. So konnte festgestellt werden, dass nach vollständiger saurer Hydrolyse rund 44% weniger meGlcA enthalten ist als nach enzymatischer Hydrolyse. Letztere spaltet die Polysaccharide aber nicht vollständig, sodass Partikel mit Durchmessern zwischen 0,1 und 6 µm in den Hydrolysaten verbleiben. Folglich sind auch die Summen detektierter Kohlenhydrate für die jeweiligen Zellstoffe deutlich geringer als nach saurer Hydrolyse. In einem weiteren Schritt wurden verschiedene Hölzer und Einjahrespflanzen mit dem entwickelten Verfahren analysiert. Für diese Proben ist die saure Hydrolyse unabdingbar. Grundsätzlich wurden höhere meGlcA-Gehalte ermittelt als in Literaturdaten angegeben. Der Vergleich der übrigen Kohlenhydrate ergab eine gute Übereinstimmung. Somit gelang es ein Verfahren zu entwickeln, mit dem neutrale und saure Kohlenhydratbestandteile simultan erfasst werden können.
Weiterhin wurden Derivate von Arabinoxylanen, die nach Umsetzung mit den cyclisch organischen Carbonaten Propylencarbonat (PC → XHP) und Vinylethylencarbonat (VEC → XHVE) erhalten wurden, charakterisiert. Dafür war ein hydrolytisches Verfahren notwendig, das kompatibel mit nachfolgenden massenspektrometrischen Untersuchungen ist. Dies konnte mit einer mikrowellenbasierten TFA-Hydrolyse erreicht werden. Nach reduktiver Aminierung und Ermittlung der Retentionszeiten mit HPLC-MS wurden die markierten Kohlenhydrate mittels HPLC-Fluoreszenz analysiert und quantifiziert. Die berechneten höchsten molaren Substitutionen betrugen 1,8 (XHP) beziehungsweise 2,3 (XHVE). Demnach neigt XHVE eher zur Verlängerung der Substituenten als XHP. Zudem gelang erstmals die getrennte Erfassung von Xylose- und Arabinosederivaten. Die Umsetzungsraten von Arabinose sind im Vergleich zu Xylose um bis zu 2,4-mal höher für monosubstituierte und 3,0-mal höher für disubstituierte Bausteine.
Kurzfassung auf Englisch: The analysis of xylans and xylan derivatives after hydroxyalkylation with cyclic organic carbonates requires methods that are suitable for these complex samples. These polysaccharides have a heterogeneous composition with diverse properties in terms of their composition. It is therefore necessary to separate compounds by chromatographic methods that have many structural similarities on the one hand, but significant differences in their charge and size on the other hand. Furthermore, for many constituents, such as 4-O-methyl-α-D-glucouronic acid (meGlcA) in methylglucurono¬xylans or the substituted monosaccharides in the xylan derivatives, there are no pure standards available which are suitable for quantification.
In order to develop a new method for the analysis of methylglucuronoxylans, the behavior of the polymers during hydrolysis with sulfuric acid was investigated. It was shown that the α-(1 → 2)-glycosidic bond of meGlcA to the xylose backbone is significantly stronger than the β-(1 → 4)-glycosidic bonds between the xylose units within the backbone. With intensification of the hydrolysis conditions, the constituents are subject to secondary degradation. Accordingly, only a maximum of between 55 and 64% of meGlcA can be determined, compared with the reference values from 13C NMR spectroscopy of the polymer solutions. The minimization of the secondary degradation by milder hydrolysis conditions results in partial hydrolysis and causes the presence of oligosaccharides with meGlcA as a constituent. For these compounds no pure standards are available, as well. In order to quantify all components, the carbohydrates were labeled with an UV-active tag by reductive amination with 2-aminobenzoic acid (2-AA) and 2-picoline borane. After chromatography using HPAEC, the labeled carbohydrates could be detected by UV detection with a molar detector response and quantified by 2-AA calibration. Based on the additional detection of the oligomers up to 9% more xylose and up to 85% more meGlcA were determined.
The method, consisting of reductive amination and HPAEC-UV, was transferred to complex xylan-containing products. For this purpose, a comparison of the enzymatic and acidic hydrolysis of pulp was carried out. After complete acid hydrolysis, the detectable amount of meGlcA was reduced by about 44% compared to enzymatic hydrolysis. However, the latter does not cleave the polysaccharides completely and particles with diameters between 0.1 and 6 μm remain in the hydrolysates. Consequently, the sums of detected carbohydrates for the respective pulps are also significantly lower compared to acid hydrolysis. In addition, various woods and annual plants were analyzed using the developed method. For these samples an acid hydrolysis in compulsory. In principle, higher meGlcA contents were determined as stated in the literature data. The comparisons of the remaining carbohydrates were in good agreement. Thus, a method has been developed that allows the simultaneous determination of neutral and acidic carbohydrate components.
Furthermore, arabinoxylans were characterized after derivatization with the cyclic organic carbonates propylene carbonate (PC → XHP) and vinyl ethylene carbonate (VEC → XHVE). These samples require a hydrolysis that is compatible with subsequent mass spectrometry studies. This was achieved with a microwave-assisted TFA hydrolysis, since TFA can be removed completely afterwards. After reductive amination and determination of the retention times with HPLC-MS, the labeled carbohydrates were analyzed and quantified by HPLC fluorescence. The calculated highest molar substitutions were 1.8 (XHP) and 2.3 (XHVE), respectively. Accordingly, XHVE has more extended substituents compared to XHP. In addition, the separate determination of xylose and arabinose derivatives was achieved for the first time. The conversion rates of arabinose were up to 2.4 times higher for monosubstituted and 3.0 times higher for disubstituted units compared to xylose.

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