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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-90614
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9061/


Molecular basis of IgE specificity and effector functions in allergic diseases

Molekulare Grundlagen der Spezifität und Effektorfunktion von IgE in allergischen Erkrankungen

Jabs, Frederic

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SWD-Schlagwörter: Allergologie , Immunologie , Strukturbiologie , Immunglobulin E , Allergie , Hypersensibilität , Antikörper
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Spillner, Edzard (Assoc. Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.01.2018
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 26.03.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Allergische Erkrankungen betreffen etwa ein Viertel aller Individuen in Industrienationen und die Prävalenz ist stetig steigend. Das Potential von IgE- Antikörpern als therapeutische Zielstruktur in allergischen Erkrankungen ist seit langem bekannt, jedoch ist Omalizumab derzeit der einzige anti-IgE-Antikörper, der für die Behandlung von moderatem bis schwerem Asthma und chronisch idiopathischer Urtikaria zugelassen ist. Deshalb ist es notwendig, neue immunologische Arzneimittel zur Inhibition von IgE-Antikörpern zu entwickeln. Andere anti-IgE-Moleküle sind zurzeit noch in der Entwicklung, wobei einige in klinischen Studien sind, wie der IgG1-Antikörper Ligelizumab. In der vorliegenden Doktorarbeit sollte der Bindungsmechanismus von zwei anti-IgE-Antikörpern mit strukturbasierten und funktionellen Methoden untersucht werden. Hierbei konnte erstmalig der Komplex zwischen dem Einzeldomänenantikörper IgE026 und dem humanen IgE Fc Cε3-4 kristallisiert, die Struktur aufgeklärt und ein neuer, einzigartiger Mechanismus in der anti-IgE-Therapie ermittelt werden. Das Epitop des anti-IgE-Einzeldomänenantikörpers zeigte zwar nur minimale Überlappungen mit der Bindungsstelle für den hoch-affinen IgE-Rezeptor (FcεRI), jedoch signifikante Überlappungen mit der Bindungsstelle von CD23. IgE026 agiert somit als ein funktionelles Homolog von CD23 und induziert eine strukturelle Änderung zu der geschlossenen IgE-Fc-Konformation. So vorliegend kann der FcεRI nicht binden und wird somit indirekt blockiert. Zusätzlich konnten Röntgenkleinwinkelstreuungsexperimente (SAXS) erstmalig eine substantielle Konformationsänderung des von IgE026 gebundenen IgE Fcs in Lösung aufzeigen. Mutations- und Inhibitionsstudien bestätigten die vorliegenden Ergebnisse. Bemerkenswerterweise war IgE026 dazu fähig, IgE von CD23 sowie FcεRI auf humanen Basophilen zu verdrängen und die allergen-induzierte Aktivierung zu verhindern. Die Entdeckung dieses einzigartigen Inhibitionsmechanismus‘ ermöglicht die zukünftige Entwicklung von neuen anti-IgE-Therapeutika für die Behandlung von allergischen Erkrankungen. Des Weiteren konnte Ligelizumab Fab im Komplex mit humanem IgE-Fc erstmalig kristallisiert werden, jedoch war die Auflösung von 7.1 Å zu niedrig, um die Struktur zu lösen. Die Optimierung der Kristallisationskonditionen kann vermutlich zu besser diffraktierenden Kristallen führen und einen ersten Einblick in den Bindungsmechanismus von Ligelizumab geben. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Analyse der Spezifität und Erkennung von alpha-Gal durch Patienten mit einer Allergie auf rotes Fleisch. Das Disaccharid Galaktose-α-1,3-Galaktose (alpha-Gal) ist ein ubiquitäres Kohlenhydrat, welches in Zellen und Geweben der meisten nicht zu den Primaten gehörenden Säugetieren und Neuweltaffen vorkommt. Aufgrund des fehlenden α-1,3-Galaktosyltransferasegens stellt alpha-Gal ein immunogenes Glykan für den Menschen dar. Der Sensibilisierungsmechanismus konnte noch nicht vollständig aufgeklärt werden und die verzögerte, ausgeprägte allergische Reaktion bleibt weiterhin rätselhaft. Deswegen ist es notwendig die IgE-Reaktivität von Patienten gegen alpha-Gal und andere Kohlenhydrate detaillierter zu untersuchen, um die molekularen Grundlagen der alpha-Gal-vermittelten Allergie zu verstehen. Hierfür konnte ein voll funktionaler alpha-Gal spezifischer chimärer murin/human M86-IgE Antikörper in Sf9-Insektenzellen exprimiert werden. Der Antikörper zeigte intrinsisches Potential Effektorzellen zu aktivieren, welche mit einem anti-IgE kreuzvernetzt wurden. Diese Beobachtung konnte nicht auf eine Antigen-abhängige Methode übertragen werden, was auf einen weit komplexeren Mechanismus in der Kohlenhydrat-spezifischen Aktivierung von Effektorzellen schließen lässt. Zusätzlich konnte das M86 Fab erfolgreich kristallisiert werden, was erstmalig Einblicke in die Struktur von alpha-Gal-spezifischen Antikörpern erlaubt. Die IgE-spezifische Immunantwort in Patienten mit einer Allergie gegen rotes Fleisch wurde mit Hilfe von Glykanarrays, welche eine Vielzahl von potentiellen Kohlenhydrat-IgE-Epitopen abdecken, analysiert. Hierbei besitzen Seren von Allergikern mit erhöhten sIgE-Werten zu alpha-Gal variierende Spezifitäten zu verschiedenen alpha-Gal Strukturen, verglichen mit dem alpha-Gal spezifischen, rekombinanten M86huIgE. Zusätzlich konnten IgE-Reaktivitäten zu strukturell verwandten und nichtverwandten Kohlenhydraten wie Milcholigosacchariden oder Blutgruppenantigenen beobachtet werden. Diese Ergebnisse zeigen ein Patienten-spezifisches Muster bei der Erkennung von Kohlenhydraten jenseits von alpha-Gal mit einer potentiellen Relevanz für die Aufklärung des alpha-Gal-Sensibilisierungsmechanismus‘.
Kurzfassung auf Englisch: Allergic disorders are increasingly prevalent in the developed world with more than one-quarter of affected individuals in industrialised countries. The identification of IgE antibodies as a therapeutical target in allergic diseases has been known for many years, but the difficulty has been to develop novel immunological drugs that are able to block their effect. Omalizumab is the only anti-IgE antibody approved for treatment of moderate to severe asthma and chronic idiopathic urticaria. Other anti-IgE molecules are under development, and some of them are in clinical trials such as the IgG1 antibody ligelizumab.
In this thesis, the mode of action of two anti-IgE antibodies should be investigated by structural and functional approaches. For the first time, the structure of the single domain antibody IgE026 in complex with human IgE Fc Cε3-4 was determined revealing an entirely new mechanism in anti-IgE therapy. The epitope of the anti-IgE single domain antibody showed minor overlap with the high-affinity IgE receptor (FcεRI) binding site but a significant overlap with the binding site of CD23. IgE026 acted as a functional homologue of CD23 and induced conformational changes into the closed IgE Fc conformation incompatible with FcεRI binding. For the first time, small angle X-ray data documented substantial conformational rearrangements of the IgE Fc upon anti-IgE binding in solution. Mutational analysis and inhibition studies corroborated the obtained data. Notably, the antibody was able to displace IgE from both CD23 and FcεRI on human basophils and thereby abrogated allergen-mediated activation. The discovered unique inhibitory mechanism opens up for the future development of novel anti-IgE therapeutics for the treatment of allergic diseases.
Furthermore, ligelizumab Fab was crystallised in complex with IgE Fc and an anti-IgE sdab for the first time. The resolution of 7.1 Å was not sufficient to determine the structure, but optimization of the crystallisation conditions could result in better diffracting crystals in the future and provide first insights into the binding mechanism of ligelizumab.
The second part of this thesis addressed the analysis of fine specificity and recognition of alpha-Gal by red meat allergic patients. The disaccharide galactose-α-1,3-galactose (alpha-Gal) is a ubiquitous carbohydrate in cells and tissues of most non-primate mammals and New World monkeys. Hence, alpha-Gal is an immunogenic glycan for humans, because of the lack of the α-1,3-galactosyltransferase gene. The sensitization mechanism of alpha-Gal is not entirely understood and the delayed, pronounced allergic reactions remain enigmatic. Thus, understanding the molecular basis for alpha-Gal-mediated allergies demands knowledge on patients’ IgE response to alpha-Gal and carbohydrates in general. Therefore, the fully functional alpha-Gal-specific chimeric mouse/human M86 IgE antibody was obtained from Sf9 insect cells. The antibody exhibited intrinsic potential to activate effector cells by cross-linking the FcεRI with anti-IgE, which was not translated to an antigen-dependent manner suggesting a more complex mechanism in carbohydrate-specific activation of effector cells. Additionally, the M86 Fab was successfully crystallised providing structural insights into an alpha-Gal-specific antibody for the first time.
Furthermore, the IgE-specific response in red meat allergic patients was investigated using glycan arrays covering a broad panel of potential carbohydrate IgE epitopes. Compared to the alpha-Gal-specific recombinant M86huIgE, sera of red meat allergic patients with elevated levels of sIgE to alpha-Gal exhibited IgE reactivity with varying fine specificity to different alpha-Gal structures. Moreover, the sera displayed additional IgE reactivities to structurally related and non-related carbohydrates such as milk oligosaccharides or blood group antigens. These results suggest a patient-specific signature of carbohydrate recognition beyond alpha-Gal with potential relevance for the elucidation of the alpha-Gal sensitization mechanism.

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