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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-90675
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9067/


Untersuchung molekularer Prozesse in Tumoren mit Hilfe massenspektrometrischer Methoden

Investigation of molecular processes in tumors using mass spectrometry-based methods

Kraus, Olga

pdf-Format:
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SWD-Schlagwörter: Massenspektrometrie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Proteomanalytik , MALDI-Imaging , Tumorheterogenität
Freie Schlagwörter (Englisch): Proteomics , MALDI-Imaging , Tumor heterogenity
Basisklassifikation: 35.26 , 35.23 , 35.71
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schlüter, Hartmut (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.03.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 23.03.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Die steigende Anzahl an Krebsneuerkrankungen (ca. 14 Millionen weltweit in 2012) motivieren dazu, die molekularen Prozesse der Tumorgenese detaillierter zu verstehen und neue Konzepte sowie Ansätze zur Therapie voranzutreiben. In der Tumorgenese werden durch Akkumulationen von Mutationen normalen Gewebszellen stufenweise zu malignen Tumorzellen transformiert. Die Art und Wirksamkeit der Therapieansätze gegen Tumorzellen sind unterschiedlich und basieren auf der Heterogenität der Tumore sowie des heterogenen Wachstums. Ein einzelner Tumor besteht aus zahlreichen Zellpopulationen und diese zu erfassen, ist die größte Herausforderung in der Tumorforschung.
Zur Verdeutlichung der Tumorheterogenität wurde in dieser Arbeit MALDI Imaging (MSI) angewendet. Tumore gleichen Ursprungs konnten anhand von unterschiedlichen massenspektrometrischen Signalen voneinander unterschieden werden.
Die Untersuchung der Pathogenese wurde mittels differentieller Proteomanalyse in HT29-Kolonkarzinomzellen, sowie nach Injektion der Zellen in Mäuse, in entstandenen Primär- und Sekundärtumoren (Metastasen) durchgeführt.
Hierbei wurde die Zusammensetzung der Plasmamembran- und Oberflächenproteine sowie der zytosolischen Proteine analysiert. Plasmamembran- und Oberflächenproteine wurden zunächst über Filter Aided Sample Preparation (FASP) sowie über Kopplung mit Biotin angereichert und anschließend massenspektrometrisch untersucht. Zytosolische Proteine wurden vor der massenspektrometrischen Analyse über eine zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) aufgetrennt. Signifikante Mengenunterschiede zwischen den drei Tumor-Entwicklungsstadien (Zelllinie, Primärtumor, Metastase) wurden u.a. bei den Plasmamembran- und Oberflächenproteinen Protocadherin FAT1, Integrin beta-4, Basal Zelladhäsionsprotein und Annexin A2 sowie den zytosolischen Proteinen Pyruvatkinase, Aldehyddehydrogenase 2 und alpha-Enolase detektiert. Diese Proteine waren bei der biologischen Interpretation der generierten Daten besonders interessant im Hinblick auf die Intravasation der Tumorzellen durch Umstrukturierung der Extrazellulären Matrix (ECM).

Als ein potentieller Tumorstammzellenmarker ist das Protein CD133 bekannt. Im folgenden Experiment wurde daher durch Stilllegen (knockdown, kd) von CD133 der Einfluss dieses Proteins auf das Proteom der HT29-Kolonkarzinomzellen untersucht. CD133 soll für Tumorprogression, Proliferation und Chemoradiotherapieresistenz verantwortlich sein und es wird in Verbindung zur mitochondrialen Dysfunktion gebracht. Nach der Auswertung wurden daher insbesondere Proteine der oxidativen Phosphorylierung und der Glykolyse/Gluconeogenese biologisch interpretiert. Die Ergebnisse deuten auf eine Umfunktionierung dieser metabolischen Wege hin, die zu einer langsameren Proliferation, jedoch erhöhten Migration der Tumorzellen führen könnten.
Die Ergebnisse dieser Arbeit geben Hinweise auf mögliche neue Mechanismen des HT29-Kolonkarzinoms und legen den Grundstein für weiterführende Untersuchungen der vorgestellten Proteine, um das Wissen auf dem Gebiet der Tumorgenese und Progression auszubauen. Weiterführende Erkenntnisse der molekularen Prozesse können neue Diagnostikverfahren und neue Therapieansätze im Kampf gegen Krebs ermöglichen.
Kurzfassung auf Englisch: The ever increasing number of cancer diseases (approximately 14 million worldwide in 2012) necessitates additional studies into the molecular mechanisms of tumor processes with the goal of new concepts and approaches for cancer treatment. In the tumorigenesis, the accumulation of mutations gradually leads to the transformation of normal tissue cells into malignant tumor cells. The types and efficacy of therapeutic approaches are different and therapeutic methods are chosen based on tumor heterogeneity and their heterogeneous growth. Since a single tumor consists of numerous cell populations, the biggest challenge in tumor research is to determine them.
In this work, the detection of tumor heterogeneity was accomplished using MALDI-MSI. Tumors of the same origin were distinguished from each other by different mass spectrometric signals.
Furthermore, cancer pathogenesis was examined using differential proteome analysis of HT29 colorectal cancer cells as well as tumors and metastases originated from these cancer cells. For this purpose, plasma membrane- and surface protein compositions as well as the composition of cytosol proteins were analyzed. Plasma membrane- and surface proteins were enriched by filter aided sample preparation (FASP) as well as coupling with biotin and then analyzed using mass spectrometry. Cytosolic proteins were separated by two dimensional gel electrophoresis (2DE) prior to mass spectrometric analysis. Plasmamembrane- and surface proteins as protocadherin FAT1, integrin beta-4, basal cell adhesion protein and annexin A2 as well as cytosolic proteins pyruvate kinase, aldehyde dehydrogenase 2 and alpha enolase showed significant mass differences between the different developmental stages (cell line, primary tumor, metastases). Thus, these proteins are particularly interesting in terms of the intravasation of tumor cells through restructuring of the extracellular matrix (ECM) as discussed in the biological interpretation of these findings.
CD133 is known as a potential cancer stem cell marker. Therefore in the following experiment, the protein composition of HT29 colon cancer cells before and after CD133 knockdown (kd) was examined. CD133 is responsible for tumor progression, proliferation and resistance of chemoradiotherapy. Moreover, this protein is associated with a mitochondrial dysfunction. Consequently, results were interpreted biologically with focus on proteins that are part of the oxidative phosphorylation and glycolysis/gluconeogenesis. Interpretations indicate a restructuring of different metabolic pathways potentially leading to slower proliferation, but increased migration of tumor cells.
The results of this work indicate new possible mechanisms of the HT29 colon cancer and provide the basis for further investigations of the introduced proteins. Gaining further knowledge about cellular mechanisms is crucial for the discovery of novel diagnostic methods as well as therapeutic approaches.

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