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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-91117
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9111/


Disease modelling of a phospholamban p.Arg14del mutation in hiPSC-derived cardiomyocytes

Krankheitsmodellierung der Phospholamban p.Arg14del-Mutation in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Knaust, Anika Eike

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SWD-Schlagwörter: Induzierte pluripotente Stammzelle , Tissue Engineering , CRISPR/Cas-Methode , Phospholamban , Zelldifferenzierung , Genome Editing
Freie Schlagwörter (Deutsch): Künstliche Herzgewebe , Kardiale Differenzierung , Dilatative Kardiomyopathie , Phospholamban-Mutation
Freie Schlagwörter (Englisch): Engineered Heart Tissue , Cardiomyocyte differentiation , Disease modelling , Genome editing , Human induced pluripotent stem cells , Phospholamban
Basisklassifikation: 42.13 , 30.03 , 30.00
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Oetjen, Elke (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.02.2018
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 04.05.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Phospholamban ist ein wichtiges transmembranäres SR-Protein für die Regulation der Kalziumhomöostase in der Kardiomyozyte, indem es die SERCA2a-Aktivität moduliert. Es hat demnach eine zentrale Rolle für die Erregungs-Kontraktions-Kopplung. Im Jahre 2006 wurde eine bisher unbekannte PLN Mutation in Familien mit vererbter dilatativer Kardiomyopathieform identifiziert, bei der das 14. Kodon AGA, welches für Arg14 codiert (PLN c.40-42AGAdel; p.Arg14del), deletiert ist. Diese autosomal dominante Erkrankung kommt verstärkt in den Niederlanden vor. Es wird vermutet, dass diese Mutante eine superinhibitorische Funktion aufweist, wodurch die Kalzium-Rückaufnahme in das SR vermindert, der Kalziumzyklus in der Zelle gestört und das diastolische Kalziumlevel erhöht wird. Die meisten Ergebnisse basieren auf familiären genetischen Analysen, biochemischen Daten oder transgenen Mausmodellen. Da sich jedoch die Kalziumzykluseigenschaften grundlegend zwischen Maus und Mensch unterscheiden, war es Ziel dieser Arbeit, ein humanes in vitro Modell für die PLN p.Arg14del Mutation zu etablieren mit Hilfe von krankheits-spezifischen humanen induziert-pluripotenten Stammzellen (hiPSZ) sowie CRISPR/Cas9-generierten isogenen Kontrollen. Kraft-generierende, 3 dimensionale künstliche Herzgewebe (EHT) wurden verwendet, um krankheitsspezifische Kontraktilitätsmuster zu definieren sowie potentielle molekulare pathologische Wege zu identifizieren.
Die aus Patienten isolierten Hautfibroblasten mit einer heterozygoten PLN p.Arg14del Mutation wurden zu hiPSZ reprogrammiert. Mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie wurden HDR-vermittelt isogene Kontrollen (PLNic) generiert über den DNA- sowie auch den Ribonukleoprotein-basierten CRISPR-Ansatz. Die PLNic zeigten eine fehlerfreie Korrektur des PLN-Genes, keine „off-target“-Effekte sowie einen gesunden Karyotyp. Die PLN p.Arg14del und PLNic hiPS-Zelllinien wurden unter Verwendung eines Embryoidkörperchen- und Wachstumsfaktoren-basierenden dreistufigen Protokolls erfolgreich zu kontrahierenden Kardiomyozyten differenziert. Die Kardiomyozyten wurden dissoziiert, um EHTs zu produzieren. Dies sind Fibrin-basierte, spontan kontrahierende und kraftgenerierende kleine Muskelstreifen, die zwischen zwei flexiblen Silikonbeinchen im 24-Well Format hergestellt werden. Mit Hilfe eines videooptischen Aufnahmesystems wurden Kontraktilitätsparameter zur funktionellen Analyse untersucht.
Elektrisch stimulierte PLN p.Arg14del EHTs generierten signifikant geringere Kräfte und zeigten eine verkürzte Kontraktions- aber ähnliche Relaxationszeit im Vergleich zu den isogenen Kontrollen. Außerdem wiesen die PLN p.Arg14del EHTs eine geringere Sensitivität gegenüber extrazellulärer Kalziumkonzentrationen auf sowie eine zeit- und kalziumkonzentrationsabhängige Steigerung arrhythmischer Episoden. Auf molekularer Ebene wurden um die Hälfte reduzierte PLN Proteinlevel detektiert verglichen zu PLNic EHTs. Dabei zeigten beide Zelllinien aber ähnliche relative PLN-Transkriptlevel. In PLN p.Arg14del Kardiomyozyten wurde ein 50:50 Verhältnis der PLN Wildtyp mRNA zur PLN Mutante detektiert. Darüber hinaus waren die Autophagiemarkerlevel in den PLN p.Arg14del EHTs stark erhöht. Nicht nur auf molekularer, sondern auch auf struktureller Ebene fanden sich Unterschiede. In EHT-Querschnitten erschien das Membranskelettprotein Dystrophin desorganisiert. Dennoch lieferten Kalziumtransienten (Koffein-Bolus) und Western Blot-Experimente keinen Beweis für die am stärksten akzeptierte Hypothese eines super-inhibitorischen PLN p.Arg14del Monomers aufgrund einer Pentamerdestabilisierung oder reduzierten PLN-Ser16 Phosphorylierung.
Zusammenfassend zeigte sich in den PLN p.Arg14del EHTs ein robuster kontraktiler sowie arrhythmischer Phänotyp, der in den isogenen, CRISPR-korrigierten Kontrollen nicht detektiert wurde. Insgesamt wurde mit diesem Modell ein vielversprechendes humanes Krankheitsmodelsystem als Basis für weitere Untersuchungen etabliert, um die Pathogenese der PLN p.Arg14del Mutation zu enthüllen.
Kurzfassung auf Englisch: Phospholamban is an important transmembrane SR protein regulating the calcium homeostasis of the cardiomyocyte by modulating SERCA2a activity. Thus, it has a central role in excitation and contraction coupling. In 2006 a novel PLN mutation, the deletion of the 14th codon AGA encoding for Arg14 (PLN c.40-42AGAdel; p.Arg14del), was identified in families with an inherited form of DCM. It is an autosomal dominant disorder most common in the Netherlands. It is assumed that this mutant has a super-inhibitory function, thereby suppressing the calcium re-entry into the SR and causing impaired calcium cycling as well as increased diastolic calcium levels. Most findings are based on familial genetics, biochemical data or transgenic mice models. But as calcium cycling mechanism differ substantially between mice and human the aim was to establish a human in vitro model for the PLN p.Arg14del mutation with disease-specific human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) and CRISPR/Cas9-generated isogenic controls. Force-generating, three-dimensional engineered heart tissues (EHT) were used to define a disease-specific contractility pattern and to identify potential molecular pathological pathways.
Patient-derived skin fibroblasts with a heterozygous PLN p.Arg14del were reprogrammed to hiPSC. By CRISPR/Cas9 technology isogenic controls (PLNic) were generated by homology-directed repair using both DNA- and ribonucleoprotein-based CRISPR approaches. Seamless gene-corrected PLNic showed no off-targets and a normal karyotype. The PLN p.Arg14del and PLNic hiPSC lines were successfully differentiated into beating cardiomyocytes with an embryoid body, growth factor-based three-stage protocol. The hiPSC-CM were dissociated for the generation of EHTs which are fibrin based, spontaneously beating, force generating strip format muscle strips casted between pairs of silicone posts in a 24-well format. By video-optical recording system contractile parameters were investigated for functional analysis.
Electrically paced PLN p.Arg14del EHTs developed significantly lower peak force than isogenic control EHTs with shorter contraction time but similar relaxation time. Besides, PLN p.Arg14del-EHTs were less sensitive to extracellular calcium concentrations and showed time- and concentration-dependent arrhythmias. On the molecular basis, PLN protein levels were reduced by 50% compared to PLNic EHTs, but with similar PLN relative transcript levels between the two lines. In PLN p.Arg14del carriers a 50:50 ratio of PLN wildtype to PLN mutated mRNA level was identified. PLN p.Arg14del EHTs showed a marked increase in protein levels of autophagy markers and histological evidence for disorganization of the membrane skeleton protein dystrophin. However, calcium transient (caffeine puff) and western blot experiments do not provide evidence for the most accepted hypothesis of a super-inhibitory PLN p.Arg14del monomer due to destabilization of the pentameric form or reduced PLN-Ser16 phosphorylation.
In summary, EHTs from PLN p.Arg14del-mutation carriers showed a robust contractile and arrhythmic phenotype which was absent in isogenic, CRISPR-corrected controls. Overall, with this model a promising human disease modelling platform for further investigations was established to unravel the pathogenesis of the PLN p.Arg14del mutation.

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