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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-91216
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9121/


Entwicklung eines rekombinanten Antibiotikasensorstammes von E. coli mittels gezielter Mutagenese und Reportergentechnologie

Development of a recombinant antibiotic detection systen of E. coli based on site-directed mutagenesis and reporter gene technology

Carstens, Katja

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Basisklassifikation: 42.13 , 42.30 , 42.20 , 42.49
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heisig, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.12.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 03.05.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Etablierung eines biosensorischen Nachweissystems für antibakterielle Substanzen basierend auf gezielter Mutagenese und Fluoreszenz-basierter Reportergentechnologie. Das Messsystem sollte zum einen als Detektionsmedium antibakterieller Kontaminationen in Umweltproben dienen als auch zur Entdeckung noch unbekannter Substanzen oder Naturstoffe mit antibakterieller Wirkung beitragen.
Die Basis des Messsystems bildete ein hypersensitiver Sensorstamm von E. coli, welcher mit Reporterplasmiden transformiert wurde und über die Änderungen der Fluoreszenzintensität einer uninduzierten Probe in Bezug zu mit Antibiotika behandelten Proben, die Anwesenheit antibakteriell wirkender Substanzen nachweisen sollte. Als Sensorstamm für das Messsystem wurde E. coli C600 gewählt, ein E. coli-Stamm, der genotypisch keine Antibiotikaresistenzen aufwies und somit das Untersuchungsspektrum nicht einschränkte. Des Weiteren besitzt E. coli C600 für das Messsystem essentielle Nährstoffauxotrophien, über die der Erhalt des Reporterplasmides in dem Untersuchungsmedium M9 während Anzucht und Fluoreszenzmessung gewährleistet wurde. Die erhöhte Sensitivität des Sensorstammes wurde durch den Funktionsverlust von TolC, einem zentralen äußeren Membranprotein in E. coli, erzielt. Hierdurch resultierten ein verminderter Efflux toxischer Substanzen, unter anderem auch von Antibiotika, und deren verstärkte intrazelluläre Akkumulation.
Das Reportersystem bestand aus einem Fusionsprodukt eines durch Antibiotika induzierbaren Promotors und dem Strukturgen von GFPmut2, einer GFP-Variante mit verstärkter Fluoreszenzintensität. Der Ausgangspunkt für die Wahl des Promotors der Reporterkonstruktion basierte auf der von Kohanski et al. 2007 veröffentlichen Publikation, in der erstmalig die Hypothese eines gemeinsamen, von der primären Zielstruktur unabhängigen, Wirkmechanismus bakterizider Antibiotika aufgestellt wurde (Kohanski et al., 2007). Die Ursache der letalen Wirkung beschrieben Kohanski et al. in einer metabolischen Kaskade, welche als Endpunkt die vermehrte Bildung von Reaktiven Sauerstoffspezies, insbesondere Hydroxylradikalen, aufweist. Mittels qRT-PCR wurde der Sensorstamm E. coli R7 auf eine veränderte Genexpression von Proteinen innerhalb dieser Kaskade sowie aus relevanten Schutz- und Reparatursystemen nach Behandlung mit bakterizid wirkenden Antibiotika untersucht und der Promotor der Succinat-Dehydrogenase aus Atmungskette und Citratzyklus als potentieller Promotor für die Reporterkonstruktion verwendet. Fluoreszenzmessungen mit dem Reportersystem zeigten jedoch keine spezifische Zunahme der Fluoreszenzintensität unter Zugabe von bakteriziden Antibiotika. Die Ergebnisse der Fluoreszenzmessungen führten dazu, dass der zuvor verfolgte Ansatz der Hypothese des gemeinsamen Wirkmechanismus verworfen und eine neue Vorgehensweise zur Beantwortung der Dissertationsfrage gewählt wurde. Anstelle eines einzelnen Reportersystems zum Nachweis ausschließlich bakterizider Antibiotika, wurden daher drei Reportersysteme bzw. -plasmide konstruiert, die auf Antibiotika induzierte Stressreaktion in der Zelle ansprachen:
1. das Reporterplasmid pHPKC3-06, zum Nachweis von DNA-Schäden über die Aktivierung der SOS-Antwort,
2. das Reporterplasmid pHPKC3-08, zum Nachweis von Zellhüllstress über das Cpx-Zwei-Kompartiment-System und
3. das Reporterplasmid pHPKC3-13, zum Nachweis von AmpC-induzierenden Störungen der Zellwandsynthese.
Der Sensorstamm E. coli R7 wurde mit den Reporterplasmiden transformiert und nach Behandlung mit Antibiotika die Fluoreszenzintensität gemessen. Während die Fluoreszenzmessungen mit pHPKC3-06 einen spezifischen und sensitiven Nachweis für die entsprechenden Antibiotikaklassen lieferten, zeigten die Ergebnisse der Fluoreszenzmessung für das Messsystem zum Nachweis von Störungen der Zellwandsynthese die Notwendigkeit eines ampD-negativen Stammhintergrunds. Dem entsprechend wurde für dieses Reportersystem der Sensorstamm E. coli R7 gegen den ampD-negativen Stamm E. coli SN0302 substituiert. Das Reporterplasmid pHPKC3-08 lieferte, entgegen den Erwartungen, keinen selektiven Nachweis von Zellhüllstress. Das Reportersystem konnte jedoch aufgrund hoher Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzdaten zum Nachweis von Proteinbiosynthesehemmern sowie des Transkriptionsinhibitors Rifampicin herangezogen werden.
Als Erweiterung der Arbeit wurden die drei Messsysteme zu einem gemeinsamen kombiniertem Messsystem auf dem Plasmid pHPKC3-14 vereint. Abschließend wurde in einem verblindeten Versuch mit dem kombiniertem Messsystem erfolgreich der Nachweis eines ß-Laktamantibiotikums, eines Proteinbiosynthesehemmers sowie eines Fluorchinolons in unbekannten Proben erbracht.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this approach was the establishment of a biosensoric detection system for antibiotic traces based on fluorescence reporter gene technology and selective mutagenesis. The purpose of the measurement system was to detect antibiotic contaminations within environmental samples as well as to contribute to the development of new substances with an antibiotic effect.
The basis of the detection system was constituted by a hypersensitive sensor strain of E. coli which was transformed with different reporter plasmids. The principle of detection depended on changes within the fluorescence intensity of induced samples compared to non-induced samples. The chosen strain was E. coli C600, an E. coli strain without an antibiotic resistance marker in its genotypic background entailing that any restrictions within the spectrum of investigations had thereby been prevented from the beginning. In addition, E. coli C600 exhibits nutrient auxotrophies to sustain the reporter plasmid in the cell while culturing and measuring the strain in the M9 medium. The hypersensitivity of the strain was achieved by the deletion of tolC, coding for a central outer membrane protein in E. coli, while reducing the bacterial efflux of toxic substances and increasing their concentrations by intracellular accumulation.
The reporter system depended on a fusion product of an antibiotic inducible promoter and the structure gene of GFPmut2, a GFP variant with enhanced fluorescence intensity. The initial point for the selection of the promoter in the reporter construction was the publication of Kohanski et al. in 2007, which for the first time proposed the hypothesis of a common mode of action of bactericidal antibiotics irrespective of their primary target (Kohanski et al., 2007). According to Kohanski et al. the real cause of the lethal impact is attributed to a metabolic cascade which leads to an endpoint with an increased formation of reactive oxygen species, particularly of hydroxyl radicals. Via qRT-PCR the altered gene expression of proteins being a part of the cascade and of relevant protection and reparation systems was examined following to antibiotic treatment.
Hence, the promoter of the succinate dehydrogenase, an enzyme of the electron transport chain and the citrate cycle, was determined as a potential promoter for the reporter construction. However, the construction of the reporter plasmid did not present any specific increment of fluorescence after having been treated with bactericidal antibiotics. Augmented discussions with regard to Kohanski´s hypothesis as well as the results of the fluorescence measurements led to a change during the procedure of the graduation work. Instead of one single reporter system exclusively detecting bactericidal antibiotics, three independently targeted reporter plasmids were constructed in order to detect different antibiotic induced stress responses:
1. the reporter plasmid pHPKC3-06, for the detection of DNA damages via the SOS response,
2. the reporter plasmid pHPKC3-08, for the detection of envelope stress via the Cpx two-component system and
3. the reporter plasmid pHPKC3-13, for the detection of AmpC induced perturbations of the cell wall synthesis.
The sensor strain E. coli R7 was transformed with the reporter plasmids pHPKC3-06, pHPKC3-08 and pHPKC3-13 and after antibiotic treatment the fluorescence intensity was determined, compared to a non-induced sample. While the fluorescence measurements with pHPKC3-06 provided the successful detection of the corresponding antibiotic classes, the functionality of the reporter system to detect perturbations in the cell wall synthesis was dependent on an ampD-negative strain background. Therefore, the sensor strain E. coli R7 for this reporter system was replaced with the ampD-negative E. coli SN0302. Against expectations the reporter plasmid pHPKC3-08 didn´t provide evidence of a selective detection of envelope stress. But due to the high reproducibility of fluorescence results the reporter system was used for detection of protein biosynthetic inhibitors and the transcription inhibitor rifampicin.
In an expansion of the graduation work and in order to reduce the required work and experimental procedure the three reporter systems were unified into a single measurement system, represented as the plasmid pHPKC3-14. In a concluding and blind examination the unified measurement system demonstrated the successful detection of a ß-lactam, a protein synthesis inhibitor and a fluoroquinolone in unknown samples.

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