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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-91587
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9158/


Nanobodies als Werkzeuge zur Optimierung Adeno-assoziierter Viren für die Gen- und Tumortherapie

Eichhoff, Anna Marei

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SWD-Schlagwörter: Dependoviren , Antikörper
Freie Schlagwörter (Deutsch): Nanobody , AAV , Einzeldomänen-Antikörper , Adeno-assoziierte Viren
Basisklassifikation: 44.45
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.05.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 07.06.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Adeno-assoziierte Viren (AAVs) werden erfolgreich als Vektoren in der Gen- und Tumortherapie angewendet. Sie sind nicht pathogen, wenig immunogen und führen zur langfristigen Expression des übertragenen Transgens. Eine Herausforderung in der Verwendung von AAVs als Vektoren in der Gentherapie ist ihr breiter Tropismus, d.h. die parallele Infektion mehrerer Gewebe und Zelltypen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Zellspezifität von AAVs mit Hilfe von Membranprotein-spezifischen Nanobodies - einzelne Antigen-bindende Domänen der einzigartigen Schwere-Ketten-Antikörper der Kameliden - zu verbessern. Die von diesen Nanobodies erkannten Membranproteine P2X7, ARTC2.2 oder CD38, wurden als neue Rezeptoren für die AAV Serotypen AAV1 und AAV2RA evaluiert (AAV2RA ist eine Variante, bei der zwei für die Bindung an HSPG essentielle Arginine zu Alaninen mutiert sind). Dabei wurden zwei Nanobody-basierte Strategien entwickelt.
Die erste Strategie umfasst die genetische Insertion eines Nanobodies in eine exponierte Oberflächenschlaufe des viralen Capsidproteins VP1 von AAV2RA. Nanobody-tragende AAVs zeigten in allen Fällen eine spezifische Bindung an Zielzellen, die das vom Nanobody erkannte Membranprotein auf der Oberfläche exprimierten, sowie eine wesentlich effizientere Transduktion der Zielzellen mit dem AAV-kodierten GFP-Reportergen.
Als zweite Strategie wurden bispezifische Adapterproteine entwickelt, die jeweils einen Membranprotein spezifischen Nanobody über einen flexiblen Peptidlinker mit einem AAV-spezifischen Nanobody verbinden. Adapter, die den AAV1/AAV2 dualspezifischen Nanobody 152 tragen, vermittelten für alle drei evaluierten Membranproteine eine stark erhöhte spezifische Transduktion der Zielzellen mit AAV1 ebenso wie mit AAV2RA.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die drei evaluierten Membranproteine (P2X7, CD38, ARTC2.2) trotz struktureller Unterschiede in der Membranverankerung (Multi-span Homotrimer, Typ-II single span, GPI-Anker) als Zielrezeptoren für die Nanobody-assistierte Bindung und Transduktion von AAVs dienen können. Die beiden hier vorgestellten Nanobody-basierten Strategien zur Verbesserung der Zellspezifität von AAVs stellen interessante neue Ansätze dar, Adeno-assoziierte virale Vektoren für die Gentherapie zu optimieren.
Kurzfassung auf Englisch: Adeno-associated viruses (AAVs) are used as vectors in gene and tumor therapy, since they are non-pathogenic, show low immunogenicity, and confer long-term expression of the transferred gene. A challenge in the use of AAVs as vectors in gene therapy is their broad tropism, i.e. the parallel infection of several tissues and cell types. The goal of this thesis was to improve the cell specificity of AAVs with the aid of membrane protein specific nanobodies - the single antigen binding domain of the unique heavy-chain antibodies of camelids. The membrane proteins recognized by these nanobodies, P2X7, ARTC2.2, or CD38, were evaluated as new potential receptors for two AAV serotypes, AAV1 and AAV2RA. Two nanobody-based strategies were developed.
The first strategy involves the genetic insertion of a nanobody into an exposed surface loop of the viral capsid protein VP1 of AAV2RA (a variant in which two arginine residues essential for binding to HSPG are substituted by alanine). For each of the evaluated membrane proteins, incorporation of the nanobody into the viral capsid resulted in both specific binding to cells expressing the respective membrane protein, and specific transduction of these cells by the AAV-encoded GFP-reporter gene.
As a second strategy, a membrane protein-specific nanobody was genetically fused via a flexible peptide linker to an AAV-specific nanobody, thereby generating bispecific nanobody-based adapter proteins. Adapters carrying the AAV1/AAV2 dual-reactive nanobody 152 strongly and specifically enhanced the transduction of cells expressing the respective membrane protein by both AAV1 and AAV2RA.
The results show that all three evaluated membrane proteins (P2X7, CD38, ARTC2.2) can serve as target receptors for nanobody-assisted transduction of AAVs, despite striking structural differences in their membrane anchorage (multi-span homo trimer, type-II single span, GPI-anchor). The two engineering strategies for the nanobody-based improvement of the cell specificity of AAVs provide the basis for new approaches to optimize Adeno-associated viral vectors for gene therapy.

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