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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-91849
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9184/


Herstellung und Charakterisierung von Lama Schwere-Ketten-Antikörper produzierenden transgenen Mäusen

Generation and characterization of llama heavy chain only antibody producing transgenic mice

Eden, Thomas

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SWD-Schlagwörter: Antikörper , Lama , Hausmaus , Gentechnologie , Immunologie , Molekularbiologie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Nanobody , Schwere-Ketten-Antikörper , IgH-Lokus , BAC-Rekombination , transgene Mäuse
Freie Schlagwörter (Englisch): nanobody , heavy chain only antibody , IgH-locus , BAC recombineering , transgenic mice
Basisklassifikation: 42.32 , 42.20 , 42.30 , 42.15 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Koch-Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.04.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 21.06.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Lamas und andere Kameliden tragen eine Variante des Schwere-Ketten-Immunglobulin-Genlokus (IgH-Lokus), der die Produktion reiner Schwere-Ketten-Antikörper ermöglicht. Die variable Domäne dieser Antikörper (VHH oder Nanobody) zeichnet sich durch hohe Stabilität und Löslichkeit sowie gute Gewebepenetration aus. Nanobodies werden meist aus immunisierten Kameliden oder synthetischen Bibliotheken gewonnen. Mäuse sind für die Produktion von monoklonalen und rekombinanten Antikörpern besonders geeignet. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung Lama IgH-transgener Mäuse als Basis für die Produktion von Schwere-Ketten-Antikörpern in Mäusen. In vorangegangenen Arbeiten in der AG Nolte am Institut für Immunologie des UKE war der Kernbereich des Lama glama IgH-Lokus in zwei überlappenden BACs (bacterial artificial chromosomes) kloniert und sequenziert worden (Wesolowski, 2011).
In der vorliegenden Arbeit sollten die essentiellen Elemente für die Produktion von Schwere-Ketten-Antikörpern mittels BAC-Rekombination auf einem DNA-Fragment vereint werden. Es wurden drei DNA-Konstrukte hergestellt: TE01 enthält je ein funktionales VHH- und VH-Gen, alle D- und J-Elemente, den IgM-Lokus, den IgG2b-Lokus, sowie Teile der Maus 3’Lokus-Kontrollregion (engl.: Locus Control Region, 3’LCR). TE02 enthält zusätzlich fünf weitere Lama VHH-Gene mit murinen Promotoren sowie größere Teile der Maus 3’LCR. TE03 enthält dieselben Elemente wie TE02, jedoch mit Maus-Exonen für die Transmembran- und membranproximalen Domänen des IgM. Diese DNA-Konstrukte wurden durch pronukleäre Injektion auf Mäuse übertragen. Für alle Konstrukte konnten Nachkommen identifiziert werden, die das vollständige transgene DNA-Fragment weitervererbten. Nach Rückkreuzung auf B-Zell-defiziente IgH-KO Mäuse, wurde für alle Transgene mittels Durchflusszytometrie von Blutlymphozyten eine Rekonstitution der B-Zell-Entwicklung nachgewiesen. Der höhere Anteil zirkulierender B-Zellen bei TE03-transgenen Mäusen spricht für die Funktionalität der optimierten regulatorischen Elemente. Zur Induktion antigen-spezifischer Schwere-Ketten-Antikörper wurde eine TE01-transgene Maus mit AAV1 (Adeno Assoziierter Virus Serotyp 1) immunisiert. Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurde das VHH-Repertoire aus cDNA von Lymphknoten, Milz und Knochenmark PCR-amplifiziert und mittels DNA-Tiefensequenzierung analysiert. Die Ergebnisse bestätigen produktive VDJ-Rekombinationen, die Expansion von B-Zell-Klonen, den Klassenwechsel von IgM zu IgG, sowie eine ausgeprägte somatische Hypermutation in einigen expandierten Klonen. Die Ergebnisse dieser Arbeit bereiten eine neue Basis für die Gewinnung von Nanobodies aus transgenen Mäusen.
Kurzfassung auf Englisch: Llamas and other camelids carry a variant of the immunoglobulin heavy chain gene locus (IgH locus), which allows the generation of antibodies composed only of heavy chains. The single variable domain of these antibodies (termed VHH or nanobody) is characterized by high stability and solubility as well as good tissue penetration. Nanobodies are isolated from immunized camelids or synthetic libraries. Mice are well suited for the production of monoclonal and recombinant antibodies. The aim of this work was the generation of llama IgH transgenic mice as a basis for the production of heavy chain antibodies in mice. In a previous work in the Nolte lab at the Institute of Immunology of the UKE, the core region of the Lama glama IgH locus had been cloned and sequenced in two overlapping BACs (bacterial artificial chromosomes) (Wesolowski, 2011).
In this work, BAC recombineering technology was used to combine the essential elements for the production of heavy chain antibodies in a single DNA construct. Three constructs were generated: TE01 contains one functional VHH gene, one functional VH gene, alle D und J elements, the IgM locus, the IgG2b locus, and parts of the mouse 3’locus control region (3’LCR). TE02 contains five additional llama VHH genes with mouse promoter regions and a larger part of the mouse 3’LCR. TE03 contains the same elements as TE02, but with mouse (instead of lama) exons encoding the transmembrane and membrane-proximal domains of IgM. These constructs were transferred to mice by pronuclear injection. Germline transmission was confirmed for all transgenes. After backcrossing to B cell deficient IgH-KO mice, flow cytometry analyses of blood lymphocytes confirmed that all constructs reconstituted B cell development. The higher fraction of B cells in TE03 mice indicates the functionality of the optimized regulatory elements. To induce an antigen-specific heavy chain antibody response, a TE01 transgenic mouse was immunized with AAV1 (adeno associated virus serotype 1). Three days after the last boost, the VHH repertoire was PCR amplified from lymph node, spleen and bone marrow cDNA, and analyzed by next generation sequencing. The results confirm productive VDJ recombination, class switch from IgM to IgG, the expansion of some B cell clones and extensive somatic hypermutation in some expanded clones. The results of this work provide a novel basis for generating antigen-specific nanobodies from transgenic mice.

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