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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-92505
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9250/


Kritische Untersuchung der Eignung des ATP-Stoffwechsels von T-Lymphozyten als Parameter für das Immunmonitoring

Critical examination of the suitability of ATP metabolism of T lymphocytes as a parameter for immunomonitoring

Nicola, Jan-Andrei

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SWD-Schlagwörter: Lymphozyt , ATP , Immunologie , T-Lymphozyt , Durchflusscytometrie , ATP-Stoffwechsel , Adenosinrezeptor , Purinozeptor , IL-2 , CD8 , CD25 , CD62L
Freie Schlagwörter (Deutsch): CD4 , P2X7 , A2A , CD38 , CD69
Basisklassifikation: 44.45
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Haag, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.07.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 01.08.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Die Bedeutung von ATP als Botenstoff und seine Wirkung auf verschiedene Rezeptoren wurde in den letzten Jahren intensiv erforscht. Der durch ATP aktivierte Rezeptor P2X7 nimmt hier aufgrund seiner weiten Verbreitung auf Zellen des Immunsystems eine Sonderstellung ein.
Der ATP-Stoffwechsel von CD4-Zellen als Maß für die immunologische „Fitness“ von T-Zellen findet beim kommerziellen ImmuKnow®-Kit klinische Anwendung, der durch Messung des intrazellulären ATP-Spiegels (iATP) in CD4-Zellen Rückschlüsse auf den Immunstatus immunsupprimierter Patienten zulässt. In dieser Arbeit wurde zum einen die Eignung von ATP-Messungen (sowohl des intrazellulären ATP-Spiegels als auch der Menge des in die Umgebung freigesetzten ATPs) als Surrogat-Marker für die T-Zell-Aktivierung untersucht. Zum anderen wurde der Einfluss von exogen zugegebenem ATP auf die Reaktion von CD4+ T-Zellen nach Stimulation untersucht.
Im ersten Teil der Arbeit wurden die Reaktionen von T-Zellen von Maus und Mensch auf unterschiedliche stimulierende Substanzen untersucht.
Bei murinen Lymphomzellen führte Stimulation des P2X7-Rezeptors und des T-Zell- Rezeptors zur Änderung diverser Oberflächenmarker und zur Ausschleusung von ATP. Während die Stimulation von P2X7 mit einer Verminderung des intrazellulären ATP-Gehalts verbunden war, stieg dieser bei T-Zell-Rezeptor-Stimulation.
Bei humanen CD4+ T-Zellen führte die Stimulation durch Phytohämagglutinin (PHA) zur Freisetzung von ATP in den extrazellulären Raum verbunden mit einem Anstieg der intrazellulären ATP-Konzentration. Wurden die CD4-Zellen vor der Stimulation aufgereinigt fiel dieser Anstieg jedoch deutlich geringer aus. Während PHA vor allem einen Anstieg des intrazellulären ATPs bewirkte, führte Stimulation durch X-OKT3 vor allem zur Sekretion von IL-2. Die Zugabe von exogenem ATP führte in hohen Dosierungen (3mM) zu einem Absinken der intrazellulären ATP-Konzentration sowie zur Unterdrückung der IL-2-Sekretion. Der Effekt auf das iATP konnte ganz, der auf das IL-2 teilweise durch Blockade des P2X7-Rezeptors aufgehoben werden. Exogenes ATP unterdrückte auch die Proliferation von T-Zellen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Wirkungsweise des ImmuKnow®-Kits kritisch untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse in hohem Maße von den verwendeten Mikrotiterplatten abhängig war und die Aufreinigung der CD4+ T-Zellen höchst unspezifisch ist. Der überwiegende Anteil des gemessenen ATPs stammte von einer Zellpopulation, die unabhängig von der CD4- Expression an der Platte oder den Beads kleben blieb. Vorläufige Untersuchungen deuten darauf hin, dass es sich um Thrombozyten handeln könnte.
Abschließend wurde daher untersucht, ob die ATP-Ausschleusung aus CD4-Zellen nach Stimulation möglicherweise einen brauchbaren Parameter zur Messung der Immunreaktion darstellt. Dabei konnte zwar nach Zugabe von ATPase-Inhibitoren ein klarer Anstieg der extrazellulären ATP-Konzentration nach PHA-Stimulation beobachtet werden, der allerdings eine große Zellzahl voraussetzte und daher nicht als Routinetest geeignet ist.
Zusammenfassend zeigt meine Arbeit, dass der kommerziell vertriebene ImmuKnow®-Test etwas anderes misst als was er zu messen vorgibt, und daher nicht als Test zur routinemäßigen globalen Beurteilung der Immunfunktion geeignet ist. Darüberhinaus zeigt die Arbeit, dass die iATP-Konzentration und ATP-Sekretion, IL-2-Produktion und die Entwicklung verschiedener Oberflächenmarker jeweils unterschiedliche Aspekte der T-Zell-Aktivierung abbilden. Keiner dieser Einzelparameter ist geeignet, ein vollständiges Bild des Immunstatus abzugeben.
Kurzfassung auf Englisch: The role of ATP as an extracellular messenger molecule and its effects on different receptors have been widely studied in the last years. The ATP-activated P2X7 receptor plays a special role due to its ubiquitous expression on different types of immune cells.
The commercially available ImmuKnow®-Assay uses the intracellular ATP (iATP) content of CD4+ cells as a marker for the immunological „fitness“ of t cells that allows to draw conclusions about the immune state of immunosuppressed patients. In this thesis I examined whether ATP levels (both intra- and extracellular) qualify as surrogate markers for t cell activation. The influence of exogenously added ATP as a costimulatory substance during CD4+ cell stimulation was also examined.
In the first part of this thesis the reactions of murine and human t cells to different stimulating substances were examined. Murine lymphocytes showed a release of ATP and a change in different surface markers following to P2X7 and t cell receptor stimulation. While P2X7 stimulation led to a decrease in intracellular ATP levels, t cell receptor stimulation increased intracellular ATP concentrations.
In human CD4+ cells stimulation with phytohemagglutinin (PHA) led to ATP release into the extracellular space and an increase in intracellular ATP levels. When isolated CD4+ cells were stimulated, this increase was much lower. PHA stimulation predominantly raised the levels of intracellular iATP, while X-OKT3 stimulation mainly led to IL-2 secretion with little effect on iATP. Adding high doses of ATP (3mM) decreased iATP levels and IL-2 secretion. The drop in IL-2 secretion was partly antagonized by P2X7 inhibitors, the drop in iATP levels was fully antagonized. High levels of extracellular ATP also inhibited t cell proliferation.
In the second part of this thesis the operational mode of the ImmuKnow®-Assay was examined. The reproducibility of measurements was highly dependent on the microtiter plates that were used, and the positive selection of CD4+ cells on microtiter plates was highly unspecific. The main part of the detected ATP levels came from a cellular population that bound unspecifically to the plate or the beads independently of CD4 expression. Initial examinations suggest that this population might be thrombocytes.
Finally I examined whether ATP release from stimulated CD4+ might be a useful parameter for monitoring immune reactions. Increases in extracellular ATP levels were detectable after PHA stimulation only when ATPase inhibitors were added, but large numbers of cells were needed. Therefore this method is not suitable as a routine test.
In summary, the results of this thesis show that the ImmuKnow®-Assay measures something different from what it claims to measure (the iATP content of CD4+ cells). Therefore we do not consider it appropriate as a global measure of immune function. In addition, this thesis shows that iATP levels and ATP-secretion, IL-2 production and expression of surface markers represent different aspects of t cell activation. None of these parameters by themselves are appropriate to give a complete representation of the immune status.

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