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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-92896
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9289/


Modeling of hypertrophic cardiomyopathy and assessment of gene therapy in human iPSC-derived cardiomyocytes

Modellierung der Hypertrophen Kardiomyopathie und Evaluierung von Gen-Therapien in humanen induziert pluripotenten Stammzell-Kardiomyozyten

Prondzynski, Kamill Maksymilian

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Basisklassifikation: 42.20 , 42.15 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Carrier, Lucie (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.07.2018
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 01.10.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Induziert pluripotente Stammzellen (iPSC) und ihre Fähigkeit in alle Zellarten zu differenzieren ermöglicht eine neue Art und Weise humane Krankheiten zu modellieren. Dies eröffnet die Chance neue Einblicke in pathophysiologische Mechanismen zu gewinnen und neue Therapien in genetischen Krankheiten, wie der Hypertrophen Kardiomyopathie (HCM), zu testen. HCM ist eine autosomal dominant vererbte Krankheit, welche durch die chaotische Orientierung von Kardiomyozyten (CMs), einer Verdickung der linken Herzkammer und einer diastolischen Dysfunktion charakterisiert ist. Bis heute sind die molekularen Mechanismen zwischen genetischer Grundlage und klinischem Ausgang in der HCM nicht klar. Zusätzlich wurde noch keine heilende Therapie beschrieben. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit mit CMs aus human induziert pluripotenten Stamzellen (hiPSC-CMs) HCM zu modellieren und Gentherapie zu testen. Dafür wurden drei Zelllinien zur Verfügung gestellt: Eine Kontrollzelllinie, von einem gesunden Individuum und zwei Zelllinien von Patienten die mit HCM diagnostiziert wurden, aufgrund jeweils einer Mutation im MYBPC3 Gen (c.1358dupC; p.Val454CysFsX21) und im ACTN2 Gen (c.740C>T; p.Thr247Met). Für die Herstellung von hiPSC-CMs wurde ein neues Differenzierungsprotokoll entwickelt, welches auf der Formation von Embryoid-Körpern basiert, preiswert ist und hohe Reinheiten an hiPSC-CMs aufweist. Dieses Protokoll wurde erfolgreich für alle in dieser Arbeit untersuchten Zelllinien verwendet. Die MYBPC3 mutierten hiPSC-CMs zeigten ein verändertes Genexpression-Profil (GP), Haploinsuffiziens und erhöhte Zellgrößen, alles Kennzeichen der HCM. Zusätzlich wurde erfolgreich Trans-Splicing in den Kontroll (Ktl) hiPSC-CMs getestet, jedoch mit einer geringen Effizienz. Behandlung mit GR unter der Verwendung der vollständigen MYBPC3 Sequenz resultierte in 2,5-fach höheren MYBPC3 Transkripten und das cMyBP-C Level wurde wieder auf 81% der Ktl gehoben, Hypertrophy unterdrückt und teilweise wurde das GP wieder dem der Ktl angepasst. CRISPR/Cas9 wurde verwendet um die vorliegende ACTN2 Mutation zu reparieren und somit eine isogene Ktl-Zelllinie herzustellen. Untersuchung von ACTN2 mutierten hiPSC-CMs zeigte 1,8-fach erhöhte Zellgrößen in 2D und eine signifikant höhere Kraft und Relaxationszeit in künstlich hergestelltem Herzgewebe im Vergleich zur isogenen Ktl-Zelllinie. Diese Arbeit liefert Beweise für das erfolgreiche modellieren der HCM und die Anwendung von neuen Therapien in hiPSC-CMs.
Kurzfassung auf Englisch: Induced pluripotent stem cells (iPSCs) and their ability to differentiate into any kind of cell offers an exceptional human disease model as patient-derived iPSC lines can be generated with disease-relevant mutations. This constitutes a unique chance in understanding molecular pathophysiology and for evaluation of new therapeutic options in genetic diseases, such as Hypertrophic cardiomyopathy (HCM). HCM is an autosomal-dominant disease, characterized by myocardial disarray, left ventricular hypertrophy and diastolic dysfunction. Molecular links between genetics and clinical outcome are still elusive and no curative treatment is available up to date. Therefore the aim of this study was to evaluate human iPSC-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) as a tool to model HCM and for assessment of trans-splicing, gene replacement (GR) and CRISPR/Cas9 genome editing as molecular-based interventions. Three different iPSC lines were provided: one control cell line derived from a healthy individual and two cell lines derived from HCM patients identified with novel mutations in the MYBPC3 (c.1358dupC; p.Val454CysFsX21) or the ACTN2 (c.740C>T; p.Thr247Met) gene at the heterozygous state. For generation of hiPSC-CMs a new differentiation protocol was developed, which is embryoid body-based, cost-effective and generates high purity of hiPSC-CMs. This protocol was successfully applied to all investigated cell lines in this thesis. MYBPC3 mutant hiPSC-CMs showed higher mRNA levels of proteins associated with hypertrophy, lower mRNA levels of proteins involved in calcium handling, haploinsufficiency and larger cell size, all hallmarks of HCM. Additionally, successful trans-splicing was observed using control hiPSC-CMs, although with low efficiency. Treatment with GR using the full-length MYBPC3 cDNA resulted in 2.5-fold higher MYBPC3 mRNA levels in MYBPC3 mutant hiPSC-CMs and control hiPSC-CMs. This restored the cMyBP-C level to 81% of the control level, suppressed hypertrophy, and partially restored gene expression to control level in HCM cells. CRISPR/Cas9 genome editing was used for the generation of an isogenic control cell line repairing the ACTN2 mutation. Evaluation of the ACTN2 mutant hiPSC-CMs revealed 1.8-fold higher cell areas in 2D and a significantly higher force and prolongation time in engineered heart tissues (EHT), when compared to isogenic control hiPSC-CMs. This work provides evidence for successful disease modeling of HCM and the application of molecular-based interventions in hiPSC-CMs.

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