FAQ
© 2018 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-93070
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9307/


Characterization of circulating microRNAs as potential biomarkers for dementia

Charakterisierung zirkulierender mikroRNAs als potentielle Biomarker für Demenzen

Denk, Johannes

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (9.218 KB) 


SWD-Schlagwörter: Demenz , miRNS , Biomarker , Polymerase-Kettenreaktion , Alzheimerkrankheit , Frontotemporale Demenz , Non-coding RNA , Serum , Liquor cerebrospinalis
Freie Schlagwörter (Deutsch): mikroRNA
Freie Schlagwörter (Englisch): microRNA , RT-qPCR , MIQE , miR-146a , CSF
Basisklassifikation: 42.20 , 44.91 , 42.13 , 44.68
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Wiedemann, Klaus (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.09.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 01.10.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Aktuell gibt es keinen einzigen Parameter, der den hohen Anforderungen eines
aussagekräftigen Biomarkers zur Diagnose von schwerwiegenden Formen von
Demenzen wie der Alzheimer Krankheit entspricht. MikroRNAs sind kleine, nichtkodierende Ribonukleinsäuren, die die Aktivität von Genen regulieren und durch ihre
positiven Eigenschaften vielversprechende Kandidaten als Biomarker in der
Diagnostik und als mögliche Ziele für therapeutische Maßnahmen darstellen.
In der vorliegenden kumulativen Dissertation fasse ich meinen Beitrag zu zwei
Forschungsartikeln zusammen. Sie beschreiben die Charakterisierung von
zirkulierenden mikroRNAs als alternative Biomarker für die Alzheimer Krankheit und
frontotemporale Demenzen.
In der ersten Veröffentlichung wurde zunächst ein breites Spektrum an verschiedenen
mikroRNAs in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit von Alzheimer Patienten und einer
heterogenen Kontrollgruppe mittels auf quantitativer PCR und Präamplifikation
basierender Hochdurchsatz Technologie (TaqMan OpenArray, ABI) gemessen. Es hat
sich herausgestellt, dass nur ein kleiner Teil der mikroRNAs nachgewiesen werden
konnte, wobei der Anteil stark exprimierter und damit frequentierter Signale geringer
war. Dementsprechend zeigte ein größerer Teil der Daten unvollständige
Expressionslevel, wobei diese mit der Expressionsfrequenz stärker korrelierten.
Relative Quantifizierung konnte eine Vielzahl differentiell regulierter mikroRNAs in der
Alzheimer Gruppe nachweisen. Durch den explorativen „MoR“ Algorithmus konnten
die abundanten Signale miR-1274a, miR-146a und miR-100 als reliable und die
weniger abundanten Signale miR-505-5p, miR-4467, miR-766, miR-375, miR-708,
miR-3622b-3p, miR-296, miR-219 und miR-103 als informative und mittels MANCOVA
auch als statistisch signifikante Biomarker identifiziert werden. Interessant war, dass
der Informationsgehalt einiger mikroRNA Biomarker Kandidaten im Vergleich zu den
traditionellen Alzheimer Proteinbiomarkern Tau, pTau identisch und gegenüber Aβ42
sogar höher erschien. Die Kombination aus miR-100, miR-103 und miR-375
demonstrierte schließlich eine Klassifikationsrate von 96%, wobei Kontrollen und
Alzheimer Patienten jeweils mit einer Genauigkeit von 96.4% und 95.5% korrekt
klassifiziert werden konnten. Darüber hinaus wurde ein komplexes Korrelationsmuster
von miR-146a mit Tau und Aβ42 identifiziert, wobei miR-146a eine mögliche
Regulation der Alzheimer Pathogenese beigemessen wurde. Zusammenfassend ist
der Nachweis von zirkulierenden mikroRNAs in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit
mittels Hochdurchsatz PCR möglich, wobei die als potentielle Biomarker Kandidaten
identifizierten mikroRNA vorsichtig zu bewerten sind, da die überwiegende Anzahl an
mikroRNAs nur in geringen Mengen exprimiert sind.
Basierend auf den Befunden und Limitierungen der ersten Studie als auch auf weiteren
Literaturrecherchen wurde in einer Folgestudie 1) die Nachweismethode gewechselt
(miRCURY, Exiqon) und auf eine Präamplifikation verzichtet, 2) die Anzahl der Proben
auf 44 gesunde Kontrollen und je 48 Patienten mit Alzheimer und frontotemporaler
Demenz erhöht, 3) verstärkt Qualitätskontrollen eingebaut und 4) zwei vergleichbare
Panel von je 96 mikroRNAs in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit und auch im
Blutserum gemessen. Insgesamt waren die Signale im Serum deutlich stärker
exprimiert und damit im Vergleich zu denen in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit
besser zu detektieren. Standardkurven und inter-assay Experimente zeigten, dass die
miRCURY assays auch im niedrigen Bereich linear messen können, konsistent hohe
Amplifikationseffizienzen besitzen und die Reproduzierbarkeit (Tag-zu-Tag) der
Signale im Serum bei ~ 99% und in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit bei ~97%
lag. Weitere Qualitätsmaßnahmen identifizierten Referenz-mikroRNAs zur
Normalisierung und kontrollierten mögliche Verunreinigungen durch hämolytische
Serumproben. Ein Ziel war es, den mikroRNA Pool von Gehirn-Rückenmarks-
Flüssigkeit und Blutserum zu vergleichen. Im Gegensatz zu anderen
Proteinbiomarkern wie den Neurofilamenten, konnte global jedoch keine Assoziation
zwischen Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit und Bluterserum beobachtet werden. Das
Ergebnis einer Clusteranalyse legte nahe, dass das zirkuläre mikroRNA Profil stark
dem in der Zelle ähnelt, wodurch intrazelluläre Veränderungen auch in
Körperflüssigkeiten nachzuweisen wären. Während eine Faktorenanalyse der Serum
Daten schließlich in einem komplexen 3-Faktor Modell resultierte, und gesunde
Kontrollen mit hoher diagnostischer Güte klassifizierte, zeigten die mikroRNAs in der
Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit eher moderate Unterschiede zwischen der
Alzheimer Krankheit und den frontotemporalen Demenzen. Interessant war, dass ein
erheblicher Teil der mikroRNAs des 3-Faktor Modells einerseits mit den
Proteinkonzentrationen von Neurofilamenten und andererseits mit denen von Aβ42 aus
der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit korrelierte (R2~20-40%).
Insgesamt zeigen die Versuche, dass mikroRNAs im Serum und in der Gehirn-
Rückenmarks-Flüssigkeit als potentielle Biomarker Kandidaten für die Alzheimer
Krankheit oder frontotemporale Demenzen fungieren können. Allerdings sind weitere
Studien, mit größeren Kohorten und strengeren Qualitätskontrollen notwendig, um die
Reliabilität und Reproduzierbarkeit der Daten als auch ihre Vergleichbarkeit im Feld zu
verbessern und zu gewährleisten.
Kurzfassung auf Englisch: Currently, there is not a single parameter that meets the high requirements of a reliable
biomarker to diagnose severe forms of dementia, such as Alzheimer's disease.
MicroRNAs are small, noncoding ribonucleic acids that regulate the activity of genes
and, through their beneficial properties, are promising candidates as biomarkers in
diagnostics and as potential targets for therapeutic intervention.
In this cumulative dissertation I summarize my contribution to two research articles.
They describe the characterization of circulating microRNAs as alternative biomarkers
for Alzheimer's disease and frontotemporal dementias.
In the first publication, a broad range of different microRNAs was measured in the
cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease patients and a heterogeneous control group
by means of pre-amplification-based quantitative PCR high-throughput technology
(TaqMan OpenArray, ABI). It became clear that only a small part of the microRNAs
could be detected, whereby the proportion of strongly expressed and thus frequented
signals was lower. Accordingly, a greater portion of the data showed incomplete
expression levels, which correlated more strongly with the expression frequency.
Relative quantitation identified a variety of differentially regulated microRNAs in the
Alzheimer’s group. Using the exploratory "MoR" algorithm, the abundant signals miR-
1274a, miR-146a, and miR-100 were found to be reliable and the less abundant signals
miR-505-5p, miR-4467, miR-766, miR-375, miR-708, miR-3622b-3p, miR-296, miR-
219 and miR-103 were identified as informative and by means of MANCOVA also as
statistically significant biomarkers. Interestingly, the degree of information of some
microRNA candidate biomarker was identical to that of the traditional Alzheimer protein
biomarkers tau, pTau and even higher compared to Aβ42. The combination of miR-100,
miR-103 and miR-375 finally demonstrated a classification rate of 96%, whereby
controls and Alzheimer's patients were correctly classified with an accuracy of 96.4%
and 95.5%, respectively. In addition, a complex correlation pattern of miR-146a with
Tau and Aβ42 was identified, suggesting miR-146a to be involved in the pathogenesis
of Alzheimer's disease. In summary, the study showed that the detection of circulating
microRNAs in the cerebrospinal fluid by high-throughput PCR is possible but careful
consideration should be given to the microRNAs identified as potential biomarker
candidates, since the majority of microRNAs are expressed only in small amounts.
Based on the findings and limitations of the first study as well as on further literature
research, in the follow-up study I 1) changed detection chemistry (miRCURY, Exiqon)
and profiled miRNAs without pre-amplification, 2) increased the number of samples to
44 healthy controls and 48 patients with Alzheimer's disease and frontotemporal
dementia, 3) incorporated improved quality controls and 4) measured two comparable
panels of 96 microRNAs each in cerebrospinal fluid and also in serum. Overall, the
signals were significantly more expressed in the serum and thus better to detect in
comparison to those in cerebrospinal fluid. Standard curves and inter-assay
experiments showed that the miRCURY assays also measured linearly towards the
low range, have consistently high amplification efficiencies, and the day-to-day
reproducibility of the signals in serum was ~ 99% and in cerebrospinal fluid ~ 97%,
respectively. Further quality measures identified reference microRNAs for
normalization and controlled potential contamination by hemolytic serum samples. One
goal was to compare the microRNA pool of cerebrospinal fluid and blood serum. In
contrast to other protein biomarkers such as neurofilaments, however, no association
could be observed globally between microRNA expression levels in cerebrospinal fluid
and serum. The result of a cluster analysis suggested that the circular microRNA profile
closely resembles that in the cell, which would enable and support the detection of
intracellular changes also in body fluids. While factor analysis of serum data ultimately
resulted in a complex 3-factor model classifying healthy controls with superior
performance, the cerebrospinal fluid microRNAs displayed rather moderate differences
between Alzheimer's disease and frontotemporal dementias. Interestingly, a significant
portion of microRNAs from the 3-factor model correlated on the one hand with
cerebrospinal fluid protein levels of neurofilaments and on the other hand with those of
Aβ42 (R2~20-40%).
Overall, the experiments show that microRNAs in serum and CSF can are promising
biomarker candidates for Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. However,
further studies, with larger cohorts and stricter quality controls, are needed to improve
and ensure the reliability and reproducibility of the data as well as their comparability
in the field.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende