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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-93718
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9371/


Der Einfluss Plasmid-vermittelter Chinolon-Resistenzmechanismen (PMQR) auf die Entstehung klinischer Fluorchinolon-Resistenz

The influence of plasmid-mediated quinolone-resistance mechanisms (PMQR) on the development of clinical fluoroquinolone resistance

Sfeir, Hans-Peter

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Antibiotika Fluorchinolon Resistenz Ecoli Qnr
Freie Schlagwörter (Englisch): Antibiotic Fluoroquinolone Resistance Ecoli Qnr
Basisklassifikation: 42.30
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heisig, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.07.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 19.11.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Nach anfänglich sehr großen Erfolgen bei der Bekämpfung von bakteriellen Infektionskrank-heiten durch die Einführung von Antibiotika seit den 1930er Jahren, stellt Antibiotikaresistenz heute eines der größten Gesundheitsprobleme weltweit dar, und es wird geschätzt, dass An-tibiotika-resistente Erreger die häufigste Todesursache im Jahr 2050 sein werden. Die Grün-de hierfür sind neben der unkritischen Anwendung der Antibiotika für humanmedizinische Zwecke und der unkontrollierten Anwendung für nicht-medizinische Zwecke vor allem die hohe genetische Variabilität der Bakterien, die ihnen eine leichte Anpassung ermöglicht. Dadurch werden nicht nur die im Verlauf der Evolution erworbenen Resistenzgene von Anti-biotikaproduzenten, durch die diese sich selbst schützen können, weitergegeben, sondern es können auch rasch Resistenzeigenschaften gegen rein synthetische Wirkstoffe, wie die Fluor-chinolon-Antibiotika (FQ) ausgebildet werden.
Infolge übermäßiger Anwendung von FQ sind inzwischen bei FQ-resistenten Mutanten verschiedene genetische Veränderungen identifiziert worden. Die Resistenzmechanismen sind vielfältig. Zufällig erworbene Genmutationen in Genabschnitten der beiden Typ-II-Topoisomerase-Zielstrukturen DNA-Gyrase (i.e. DNA-Topoisomerase II) und Topoisomerase IV, führen zum Verlust der Wirksamkeit der mit diesen Zielstrukturen interagierenden Fluorchinolone. Mutationen in Regulatorgenen, die zu einer Überexpression von multiple-drug resistance (mdr)-Effluxpumpen führen, verringern die effektive Konzentration der Fluorchinolone in der Zielzelle. Und schließlich sind inzwischen auch drei plasmidkodierte und damit transferierbare Resistenzmechanismen identifiziert worden: enzymatische Modifikation von Fluorchinolonen (Acetyltransferase), Effluxsysteme (QepA, OqxAB) und Gyrase/Topoisomerase IV-Schutzproteine (Qnr). Als wesentlicher Mechanismus für klinisch relevante Fluorchinolon-Resistenz, z.B. in Escherichia coli (E. coli), erweist sich eine Kombination einer Doppelmutation in der A Untereinheit (GyrA) der primären Zielstruktur DNA-Gyrase und mindestens einer Mutation in der homologen Untereinheit (ParC) der Topoisomerase IV. Diese Mutationen liegen innerhalb der QRDR (quinolone resistance-determining region).
Zusätzlich wird für Antibiotika eine Rolle als mögliche Signalmoleküle im Rahmen der Zell-Zell-Kommunikation (englisch: quorum sensing) diskutiert, die u.a. indirekt eine Überexpression von Effluxpumpen bewirken können. In E. coli kann der Transkriptionsaktivator SdiA (suppressor of cell division inhibitor) auf äußere Signalmoleküle reagieren und beispielsweise die Expression des Antibiotikumpumpsystems AcrAB-TolC verstärken.
In diesem Zusammenhang sollte in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von SdiA in den in vitro selektierten Mutanten E. coli MIII (GK574) und E. coli MIVa (GK575) untersucht werden. Für MIII und MIVa waren bereits die gleichen QRDR-Mutationen (gyrA Asp87Gly und parC Ser80Leu) und die gleiche Deletion im Regulatorgen marR, die zu einer Überexpression der AcrAB-TolC-Effluxpumpe führt, identifiziert. Jedoch fällt bei MIVa im Vergleich zu MIII die acrA-Expression höher aus, und die minimale Hemmkonzentration (MHK) des FQ-Antibiotikums Ciprofloxacin ist für MIVa um eine Stufe erhöht. Um den Unterschied zwischen MIII und MIVa zu erklären, wurde für sdiA die Sequenz mittels SANGER-Sequenzierung und Pyrosequenzierung untersucht. Zusätzlich wurde die Genzahl mittels Southern Blot und die Expression mittels real-time quantitative PCR in den beiden Mutanten MIII und MIVa ermit-telt und mit dem Wildtypstamm E. coli WT (GK571) verglichen. MIII und MIVa besaßen je-weils eine Genkopie von sdiA, die sich nicht in der Sequenz unterschieden. Die Untersuchung mittels real-time quantitative PCR zeigte, dass bei MIII die Genexpression im Vergleich zu WT um 27 % erniedrigt war, während MIVa eine Erhöhung um 42 % aufwies. Ob die erhöhte sdiA-Expression in MIVa mitverantwortlich für die MHK-Zunahme in MIVa gegenüber MIII ist, lässt sich durch die Ergebnisse dieser Arbeit vermuten. Im Unterschied zu MIII scheint bei MIVa neben der acrA-Expression auch die sdiA-Expression durch einen noch unbekannten Faktor induziert zu werden.
Das Ziel im zweiten Teil dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss der Topoisomerase-Schutzproteine QnrA1 und QnrB1 auf die Entwicklung einer FQ-Hochresistenz (oberhalb Grenzwerte gemäß EUCAST 2016) zu untersuchen. Die Anwesenheit von Qnr allein bewirkt in E. coli noch keine Ausprägung einer FQ-Hochresistenz. Dennoch werden zunehmend bei hoch FQ-resistenten Isolaten Plasmid-codierte qnr-Gene detektiert. Dieser Einfluss sollte anhand von Selektionsexperimenten mit Qnr-Transformanden untersucht werden.
Für die Untersuchungen wurde die in vitro selektierte, intermediäre Mutante E. coli MII (GK573) vorrangig als Ausgangsstamm verwendet. Diese Mutante trägt die bei E. coli häu-figste gyrA Mutation (gyrA Ser83Leu) sowie eine marR-Deletionsmutation. Die Fluorchinolon-Resistenz dieser Mutante liegt jedoch unterhalb der Grenzwerte gemäß EUCAST 2016. Nach Transformation der Mutante MII mit einem Qnr-tragenden (QnrA1 bzw. QnrB1) Plasmid wurden in-vitro resistente Mutanten unter Ciprofloxacin-Konzentrationen selektiert, die der vier- bis achtfachen minimalen Hemmkonzentration entsprachen. Trotz Abnahme der FQ-Empfindlichkeit konnte bei den in vitro selektierten Mutanten erstmalig eine FQ-Hochresistenz ohne die zusätzlichen Mutationen in gyrA und parC gezeigt werden. Durch Ge-nomsequenzierung wurde bei der selektierten Mutante MII pHPNE19-02.1 Nr. I 43 im Gen der Isocitratdehydrogenase die Deletion ∆icd 7 bp (+818 bp bis +824 bp) detektiert, die zu einem frühzeitigen Stoppcodon an der Aminosäureposition +278 führt (E. coli MII ∆icd 7 bp). Ein defektes Gen der Isocitratdehydrogenase konnte in zwei weiteren Mutanten (MII pHPNE19-02.1 Nr. III 2 und MII pHPNE18 01.1 Nr. II 18) nachgewiesen werden. Der Citratzyk-lus ist aufgrund ∆icd geblockt, da in E. coli nur ein einziges Gen für die Isocitratdehydrogena-se vorliegt. Als Alternative aktiviert E. coli den Glyoxylatzyklus dauerhaft (glyoxylate shunt). Das gleichzeitige Auftreten von qnr-Genen mit Gyrase- und Stoffwechselmutation (∆icd 7 bp) in intermediären Mutanten deutet darauf hin, dass sich diese Faktoren synergistisch auf die Ausbildung einer FQ-Hochresistenz (oberhalb Grenzwerte gemäß EUCAST 2016) auswirken.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in E. coli die Anwesenheit von Qnr die Ausbil-dung einer FQ-Resistenz durch neue Mutationen außerhalb der bekannten Zielregionen be-günstigt und gleichzeitig durch Qnr die zur Ausbildung einer FQ-Hochresistenz zusätzlich notwendigen Mutationen innerhalb der QRDR kompensiert werden.
Kurzfassung auf Englisch: After the initial success of antibiotics in combating bacterial infectious diseases from the 1930’s onward, antibiotic resistance is currently on the rise and fast becoming one of the world’s biggest health crisises. It is estimated that antibiotic-resistant pathogens will be the leading cause of death in 2050.
Increased resistance of bacteria to antibiotic drugs is the result of uncritical use of antibiotics for both medical and non-medical purposes coupled with the high genetic variability of the bacteria themselves. This genetic variability allows bacteria to pass on resistant genes ac-quired by the evolution of antibiotic producers, as well as quickly developing resistance properties against purely synthetic drugs such as the fluoroquinolone antibiotics (FQ). Cur-rently, diverse genetic alterations have been identified in FQ-resistant mutants. Randomly acquired gene mutations in gene segments of the two type II topoisomerase targeting path-ways - DNA gyrase (i.e., DNA topoisomerase II) and topoisomerase IV - result in the loss of efficacy of the fluoroquinolones interacting with these targets. Mutations in regulatory genes that result in overexpression of multiple drug resistance (mdr) efflux pumps reduce the ef-fective concentration of fluoroquinolones in the target cell. Finally, three plasmid-encoded and thus transferable resistance mechanisms have been identified: enzymatic modification of fluoroquinolones (acetyltransferase), efflux systems (QepA, OqxAB) and gyrase / topoiso-merase IV protection proteins (Qnr). As an essential mechanism for clinically relevant fluo-roquinolone resistance, e.g. in Escherichia coli (E. coli), a combination of a double mutation in the A subunit (GyrA) of the primary target DNA gyrase and at least one mutation in the homologous subunit (ParC) of topoisomerase IV is found. These mutations are within the QRDR (quinolone resistance-determining region).
Contemporary discussions concern the possibility of antibiotics functions as signal molecules in the context of cell-to-cell communication, also known as quorum sensing, which indirectly causes overexpression of efflux pumps. In E. coli, the transcriptional activator SdiA (suppres-sor of cell division inhibitor) can react to external signal molecules and enhance the expres-sion of the antibiotic pumping system AcrAB-TolC. In this context, the influence of SdiA in the in vitro selected mutants E. coli MIII (GK574) and E. coli MIVa (GK575) was investigated. For MIII and MIVa, the same QRDR mutations (gyrA Asp87Gly and parC Ser80Leu) and the same deletion in the regulatory gene marR, which results in overexpression of the AcrAB-TolC ef-flux pump, have already been identified. However, in MIVa compared to MIII, the expression of the AcrA subunit of the AcrAB-TolC efflux pump is higher and the minimum inhibitory con-centration (MIC) of the FQ antibiotic ciprofloxacin is increased by one notch for MIVa. To explain the difference between MIII and MIVa, the sequence for sdiA gene was analyzed by Sanger sequencing and pyrosequencing. In addition, the gene count was determined by means of Southern blot and expression by means of real-time quantitative PCR in the two mutants MIII and MIVa and compared with the homologous wild-type strain E. coli WT (GK571). The results showed that MIII and MIVa each had a gene copy of sdiA that did not differ in sequence.
Examination by means of real-time quantitative PCR showed that MIII gene expression was reduced by 27% compared to WT, while MIVa increased by 42%. Based on results thus far it can be assumed that the increased sdiA expression in MIVa is partly responsible for the MIC increase in MIVa over MIII. In contrast to MIII, in addition to acrA expression, MIVa also seems to induce sdiA expression by a factor which is still unknown.
The aim of the second part of this work was to investigate the influence of the topoisomerase protection proteins QnrA1 and QnrB1 on the development of high FQ resistance (above limits according to EUCAST 2016). The presence of Qnr alone in E. coli does not yet produce any expression of high FQ resistance. Nevertheless, plasmid-coded qnr-genes are increasingly being detected in highly FQ-resistant isolates. This influence of Qnr should be investigated by selection experiments with Qnr transformants.
For the investigations, the in vitro selected, intermediate mutant E. coli MII (GK573) was mainly used as parent strain. This mutant carries the most common E. coli gyrA mutation (gyrA Ser83Leu) and a marR deletion mutation. The fluoroquinolone resistance of this mu-tant is below the limits of EUCAST 2016. After transformation of the mutant MII with a Qnr-bearing (QnrA1 or QnrB1) plasmid, in vitro resistant mutants were selected at ciprofloxacin concentrations corresponding to four to eight times the minimum inhibitory concentration. Despite a decrease in FQ sensitivity, FQ resistance could be demonstrated for the first time among the in vitro selected mutants without the necessary additional mutations in gyrA and parC. By genome sequencing, the deletion Δicd 7 bp (+818 bp to +824 bp) was instead de-tected in the gene of isocitrate dehydrogenase in the selected mutant MII pHPNE19-02.1 No. I 43, which leads to an early stop codon at the amino acid position +278 (E. coli MII Δicd 7 bp).
Failure of the isocitrate dehydrogenase could be detected in two further mutants (MII pHPNE19-02.1 No. III 2 and MII pHPNE18-01.1 No. II 18). The citrate cycle is blocked due to Δicd, since there is only one single gene for isocitrate dehydrogenase in E. coli. As an alter-native, E. coli permanently activates the glyoxylate cycle (glyoxylate shunt). The co-occurrence of Qnr with gyrase and metabolic mutation (Δicd 7 bp) in intermediate mutants indicates that these factors synergistically affect the formation of high FQ resistance (above EUCAST 2016 limits).
This work demonstrates that in E. coli the presence of Qnr favors the formation of FQ re-sistance by new mutations outside the known target regions. At the same time Qnr compen-sates for the additional mutations within the QRDR necessary for the development of FQ re-sistance.

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