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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-94029
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9402/


Hepatocellular carcinoma : Establishing a new transplantation model for the study of benign and malignant clonal regeneration of the murine liver in vivo

Hepatozelluläres Karzinom : Etablierung eines neuen Transplantationsmodells für die Untersuchung der benignen und malignen klonalen Renegeration der Mausleber in vivo

Unrau, Ludmilla

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Hepatozelluläres Karzinom , Leberregeneration , Mausmodell , Lentivirale Vektoren , Onkogene
Freie Schlagwörter (Englisch): Hepatocellular carcinoma , liver regeneration , mouse model , lentiviral vectors , oncogenes
Basisklassifikation: 44.81 , 42.15 , 42.13 , 42.03 , 46.90
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Fehse, Boris (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 19.11.2018
Kurzfassung auf Englisch: One major type of primary liver cancer is the hepatocellular carcinoma (HCC), which is the second most leading cause of cancer-related mortality worldwide. Though HCC development has been investigated extensively, the phenotypic and molecular heterogeneity driving HCC initiation still remain largely unknown.
The objective of this thesis was to induce HCC formation via lentiviral-mediated gene transduction and to take advantage of the red/green/blue (RGB) marking system to develop a small animal model to study both benign and malignant clonal regeneration of the liver in vivo. One of three different transgenes, CyclinA2, HRas-V12, and LargeT-antigen, each co-expressed with a Green fluorescent gene, together with “empty” vectors expressing either Cherry (Red), Venus (yellow-Green) or Cerulean (Blue) fluorescent genes, were introduced into primary adult wild-type hepatocytes using the LeGO vector system. Intrasplenic transplantation into urokinase-type plasminogen activator/SCID/Beige (USB) transgenic mice was then performed. Tumor growth was
monitored via repeated magnetic resonance imaging screenings. At the final stage, liver transaminases (ALT) and albumin (ALB) serum concentrations were determined and cryosections and molecular analyses of livers were performed.
Transplantation of primary murine hepatocytes resulted in efficient liver repopulation of all mice. A healthy liver phenotype was observed in the mock-treated group (n=6). RGB control mice (n=12, without oncogene expression) were repopulated by numerous clones with normal ALT and ALB levels. Explanted livers showed normal phenotype with single fibrotic areas. The three different transgenes mediated distinct kinetics of liver regeneration and HCC formation. CyclinA2-transduced hepatocytes were found in small repopulated areas (n=11). Mice had normal ALT and ALB values but minor liver damage was already observable macroscopically. Early signs of malignant transformation were only observed in mice transplanted with HRas-V12-transduced hepatocytes. MRI analyses showed formation of multiple tumor nodules within 3 weeks (n=12). In these mice, ALT was slightly elevated, whereas ALB was normal. LargeT-antigen-transduced hepatocytes caused severe liver damage in transplanted mice as indicated by 6.35-fold up-regulated ALT values but normal ALB and severe tumor formation (n=12). Molecular quantification of vector copy numbers by droplet-digital PCR in relation to a reference gene was in line with immunofluorescence data of GFP and oncoprotein levels: in LargeT-antigen- and RGB-transplanted livers maximum proviral vector copy numbers were found, followed by HRas-V12-modified hepatocytes and CyclinA2-transduced cells. The adapted Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) staging classified HRas-V12 and LargeT induced hepatocellular carcinomas to an intermediate stage in this experimental setting. Based on these data, HRas-V12 is a promising candidate to study early and intermediate phases of liver carcinogenesis by lentiviral-mediated oncogene transduction and marking. The combination of sensitive cell-marking strategies and oncogene-mediated hepatocarcinogenesis in USB mice can provide new insights in the clonal evolution of HCC, and provides the necessary tools to establish a more realistic and patient-related in-vivo model for the investigation of liver cancer.
Kurzfassung auf Deutsch:
Eine der häufigsten Formen von Leberkrebs ist das hepatozelluläre Karzinom (engl. hepatocellular carcinoma, kurz: HCC), welches außerdem weltweit als zweithäufigste Ursache krebsinduzierte Letalität bedingt. Auch wenn die Entstehung von HCCs bereits eingehend untersucht wurde, sind die phänotypische und molekulare Heterogenität, welche die Initiierung von HCC bedingen, weitgehend unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit war die Induktion der HCC-Entstehung mittels Lentiviral-vermittelter Gentransduktion unter Verwendung des Rot/Grün/Blau (RGB) Markierungssystems, um ein Kleintiermodell für die in vivo Untersuchung der physiologischen aber auch der malignen klonalen Regeneration der Leber zu etablieren. Eins von drei verschiedenen Transgenen, CyclinA2, HRas-V12 und LargeT-Antigen, die jeweils ein grünes Fluoreszenzprotein ko-exprimierten, wurde zusammen mit „leeren“ Vektoren, welche das Cherry (Rot), Venus (Gelb-Grün) or Cerulean (Blau) Fluoreszenzgen exprimierten, mittels LeGO-Vektorsystem in primäre adulte Wildtyphepatozyten eingebracht. Die Hepatozyten wurden anschließend intrasplenal in vier Wochen alte transgene Urokinasetyp-Plasminogenaktivator/SCID/Beige (USB) Mäuse transplantiert. Das Tumorwachstum wurde anhand wiederholter MRT-Messungen beobachtet. Lebertransaminasen (ALT) und Albumin (ALB) Konzentrationen wurden bei der finalen Blutabnahme im Serum bestimmt, sowie Kryoschnitte angefertigt und molekulare Analysen der entnommenen Lebern durchgeführt. Die Transplantation primärer muriner Hepatozyten resultierte in effizienter Leberrepopulation in allen untersuchten Mäusen. Ein gesunder Leberphänotyp konnte in der Mock-behandelten Gruppe beobachtet werden (n=6). RGB-Kontrolltiere wiesen eine Vielzahl an transduzierten Klonen in der repopulierten Leber und außerdem normale ALT- und ALB-Werte auf (n=12, ohne Onkogenexpression). Die entnommenen Lebern waren phänotypisch gesund, jedoch mit einzelnen fibrotischen Arealen. Die drei verschiedenen Transgene zeigten jeweils reproduzierbare Kinetiken der Leberregeneration und HCC-Formation. CyclinA2-transduzierte Hepatozyten konnten in kleinen repopulierten Flächen wieder gefunden werden (n=11). Die Tiere zeigten normale ALT- und ALB-Werte und keine Tumorbildung trotz bereits makroskopisch sichtbaren geringen Leberschadens. Frühe Zeichen der malignen Transformation konnten ausschließlich in Tieren festgestellt werden, in die HRas-V12-transduzierte Leberzellen transplantiert wurden; MRT-Aufnahmen zeigten die Bildung multipler Tumore innerhalb von 3 Wochen nach Transplantation (n=12). In diesen Mäusen waren die ALT-Werte leicht erhöht, während Albumin auf normalem Level blieb. Mit LargeT-Antigen-transduzierte Hepatozyten verursachten massiven Leberschaden in transplantierten Mäusen, angezeigt durch exzessives Tumorwachstum und einen 6,35-fach hoch regulierten ALT-Wert bei normalem ALB (n=12). Molekulare Quantifizierung von Vektorkopiezahlen durch digitale PCR im Vergleich zu einem Referenzgen entsprach den mittels Immunfluoreszenz nachgewiesenen Levels von GFP und den Onkoproteinen: die maximale provirale Vektorkopiezahl wurde in LargeT-Antigen- und RGB-transplantierten Lebern gefunden, gefolgt von HRas-V12-modifizierten Hepatozyten und CyclinA2-transduzierten Zellen. Anhand des angepassten Barcelona Krankenhaus Leberkrebsbewertungssystems (BCLC system) wurden HRas-V12 und LargeT induzierte hepatozelluläre Karzinome als intermediäres Stadium eingestuft. Auf diesen Daten basierend ist HRas-V12 ein vielversprechender Kandidat für die Untersuchung früher und intermediärer Phasen der Leberkarzinogenese durch lentiviral-vermittelte Onkogentransduktion und -markierung. Die Kombination sensitiver Zellmarkierungsstrategien und Onkogen-induzierter Hepatokarzinogenese in USB-Mäusen kann zum Erkenntnisgewinn der klonalen Evolution von HCC führen und liefert die nötigen Hilfsmittel zur Etablierung eines realitätsnahen und Patientenbezogenen in vivo Models zur Erforschung von Leberkrebs.


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