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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-94262
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9426/


2-Methoxyestradiol and its derivatives decrease Ca2+ entry in human (Homo sapiens) and rat (Rattus norvegicus) T lymphocytes by inhibiting Ca2+ release-activated Ca2+ channels

2-Methoxyestradiol und seine Derivate verringern den Ca2+-Einstrom in humanen und Ratten-T-Lymphozyten durch Inhibition von Ca2+-freisetzungsaktivierten Ca2+-Kanälen

Johnsen, Anke

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SWD-Schlagwörter: T-Lymphozyt , Calcium , Calciumkanal , Estradiol , Immunsystem
Freie Schlagwörter (Deutsch): 2-Methoxyestradiol , STIM/Orai , Ca2+-Einstrom
Freie Schlagwörter (Englisch): Calcium , T-lymphocyte , 2-Methoxyestradiol , Ca2+-entry , STIM/Orai
Basisklassifikation: 35.74 , 42.15 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Guse, Andreas H. (Prof. Dr. Dr. habil.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.11.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 19.12.2018
Kurzfassung auf Englisch: 2-Methoxyestradiol (2ME2) is an endogenous estradiol (E2) metabolite which is considered to be non-estrogenic as it binds to the estrogen receptors with an at least 500 fold lower affinity compared to E2 (LaVallee et al., 2002). 2ME2 is well known for inhibiting tumor growth by downregulating proliferation of tumor cells and angiogenesis (Fotsis et al., 1994). More recently, 2ME2 was shown to also ameliorate the symptoms in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of Multiple Sclerosis (MS; Duncan et al., 2012). In this model, 2ME2 downregulates the activation of T lymphocytes by inhibiting the translocation of NFAT (nuclear factor of activated T cells), a mechanism which requires increased Ca2+ entry resulting in elevation of the free cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i; Duncan et al., 2012; Kar et al., 2016). However, it still remains unresolved if 2ME2 inhibits NFAT translocation by interfering with Ca2+ signalling pathways or with any other mechanism like directly inhibiting the dephosphorylation of NFAT. Thus, the central aim of the current study was to investigate the impact of 2ME2 on Ca2+ signalling pathways in T lymphocytes and if other endogenous steroid hormones possess similar effects. The analysis of Fura2 loaded Jurkat T lymphocytes stimulated with thapsigargin in a nominal Ca2+ free buffer revealed that increasing 2ME2 concentrations decrease Ca2+ entry after Ca2+ re-addition with an IC50 of 20 µM. In contrast to this, E2 also inhibited Ca2+ entry but not as potently as 2ME2, suggesting that the 2-methoxy group is crucial for inhibiting Ca2+ entry in T lymphocytes. On the basis of these results, 25 derivatives of 2ME2 with different side chains were analysed. This analysis revealed that the most potent 2ME2 derivatives possess 2-ethyl, a 3-hydroxy or 3-sulfamoyloxy and a hydrogen bond acceptor group at C17 which was different from a sulfamoyloxy group. The most potent compounds decreased Ca2+ entry with an IC50 of about 1 µM.
To analyse the mechanism of Ca2+ entry inhibition, I investigated K+ channels via whole cell patch clamp recordings, Ca2+ independent mechanisms by Mn2+ quenching and Ca2+ entry through CRAC/Orai channels covalently bound to a genetically encoded Ca2+ indicator (GECO). This study revealed that K+ channels and Ca2+ dependent mechanisms are not influenced but the fluorescence of GECO bound to Orai channels was decreased by 2ME2 and its derivatives. These data indicate inhibition of the STIM/Orai mediated Ca2+ entry as the target of the endogenous E2 metabolite 2ME2 in T lymphocytes. The potency of 2ME2 was increased by derivatisation, leading to a new series of potent STIM/Orai inhibitors in T lymphocytes.
Kurzfassung auf Deutsch: 2-Methoxyestradiol (2ME2) ist ein endogener Östradiol (E2)-Metabolit, der als nicht-östrogen angesehen wird, da er im Vergleich zu E2 mit einer mindestens 500-fach geringeren Affinität an die Östrogenrezeptoren bindet (LaVallee et al., 2002). 2ME2 ist bekannt für seine Inhibition des Wachstums von Tumoren durch die Reduktion der Proliferation der Tumorzellen sowie der Angiogenese (Fotsis et al., 1994). Außerdem wurde gezeigt, dass 2ME2 die Symptome in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), einem Tiermodell der Multiplen Sklerose, abmildert (Duncan et al., 2012). In diesem Model bewirkt 2ME2 eine verminderte Proliferation und Aktivierung der T-Lymphozyten durch die Inhibition der Translokation von NFAT (nukleärer Faktor aktivierter T-Zellen), eines Mechanismus‘, der einen verstärkten Ca2+-Einstrom und eine daraus resultierende höhere freie zytosolische Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) benötigt (Duncan et al., 2012; Kar et al., 2016). Bisher ist immer noch ungeklärt, ob 2ME2 die Translokation von NFAT durch die Ca2+-Signalwege oder durch andere Mechanismen, wie die direkte Hemmung der Dephosphorylierung von NFAT, inhibiert. Daher ist das zentrale Ziel dieser Studie die Untersuchung des Einflusses von 2ME2 auf die Ca2+-Signalwege in T-Lymphozyten und die Analyse, ob andere endogene Steroidhormone ähnliche Effekte aufweisen. Die Untersuchung von Fura2-beladenen Jurkat T-Lymphozyten, die mit Thapsigargin in einem nominal Ca2+-freien Puffer stimuliert wurden, zeigte, dass 2ME2 den Ca2+-Einstrom nach Ca2+-Zugabe bei einer Konzentration von 20 µM halbmaximal inhibiert. Im Gegensatz hierzu zeigte E2 eine schwächere Inhibition des Ca2+-Einstroms, was darauf hindeutet, dass die Methoxylgruppe an C2 entscheidend für die Inhibition des Ca2+-Einstroms der T-Lymphozyten ist. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurden 25 Derivate von 2ME2 mit unterschiedlichen Seitengruppen auf ihre Wirksamkeit hin untersucht. Diese Analyse zeigte, dass die potentesten Derivate eine 2-Ethyl-, eine 3-Hydroxyl- oder 3-Sulphamoyloxyl-Gruppe sowie einen Akzeptor für Wasserstoffbindungen an C17 beinhielten, wobei eine Sulfamoyloxyl-Gruppe als Akzeptor für Wasserstoffbindungen keinen positiven Effekt zeigte. Diese potentesten Substanzen inhibierten den Ca2+-Einstrom mit einer IC50 von etwa 1 µM.
Um den Mechanismus für die Inhibierung des Ca2+-Einstroms aufzuklären, habe ich K+-Kanäle per Spannungsklemmen-Ableitungen im Ganzzell-Modus, Ca2+-unabhängige Mechanismen mittels Mn2+-Quenching und den Ca2+-Einstrom durch CRAC/Orai-Kanäle durch genetisch kodierte Ca2+-Indikatoren (GECO), die kovalent an die Orai-Kanäle gebunden wurden, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass weder K+-Kanäle noch Ca2+-abhängige Mechanismen, sondern die Fluoreszenz der an Orai-Kanäle gebundenen GECO-Fluorophore durch 2ME2 und seine Derivate inhibiert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass 2ME2 auf den STIM/Orai-vermittelten Ca2+-Einstrom in T-Lymphozyten wirkt. Durch Derivatisierung wurde die Wirksamkeit von 2ME2 um das 20-fache erhöht. Somit stellen diese Substanzen eine neue Klasse von STIM/Orai-Inhibitoren in T-Lymphozyten dar.

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