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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-94555
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9455/


Pharmakologische Charakterisierung von P2X7-blockierenden Nanobodies in vitro und in vivo

Pharmacological characterization of P2X7-blocking Nanobodies in vitro and in vivo

Iacenda, Domenica

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Freie Schlagwörter (Deutsch): P2X7 , Nanobodies
Freie Schlagwörter (Englisch): P2X7 , Nanobodies
Basisklassifikation: 44.41
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Magnus, Tim (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 07.12.2018
Kurzfassung auf Deutsch: Das Immunsystem reagiert auf körperfremde Pathogene wie Bakterien oder Viren mit dem Auslösen einer Immunantwort. Zudem ist es in der Lage auf sterile Gewebeschäden zu reagieren. Die Freisetzung von intrazellulärem Adenosintriphosphat (ATP) in den extrazellulären Raum, sei es im Rahmen einer Infektion oder traumatischer Gewebeschäden, spielt dabei eine zentrale Rolle als Gefahrensignal für das Immunsystem. ATP ist ein Ligand für Purinrezeptoren, wie den P2X7-Rezeptor, welcher auf zellulärer Ebene die Freisetzung des proinflammatorischen Zytokins Interleukin 1β (IL-1β) bewirkt. Um P2X7-vermittelte Entzündungsprozesse gezielt therapeutisch unterdrücken zu können, waren in der AG Nolte am Institut für Immunologie des UKE Einzeldomänenantikörper, auch Nanobodies genannt, gegen diesen Ionenkanal bereits entwickelt worden (W. Danquah et al., 2016; W Danquah, 2012). Nanobodies sind Antikörperfragmente, die als kleinste antigenbindende Einheit fungieren. Aufgrund ihrer geringen Größe und außergewöhnlichen Struktur haben sie die Fähigkeit tief in Gewebe einzudringen und sind in der Lage, an Strukturen zu binden, die für konventionelle Antikörper schwer erreichbar sind. Sie können somit die Funktion von Enzymen oder liganden-gesteuerten Ionenkanälen, wie dem P2X7-Rezeptor, inhibieren oder verstärken.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die pharmakologischen Eigenschaften von verschiedenen Formaten des P2X7-blockierenden Nanobodies 13A7 in vitro und in vivo untersucht. Hierbei wurden 13A7-Monomere, Heterotrimere bestehend aus zwei 13A7-Monomeren und einem anti-Albumin-Nanobody (genannt 13A7dimAlb) sowie 13A7-Fc-Fusionsproteine (genannt 13A7mFc) verglichen. Anfängliche Versuche mit P2X7-exprimierenden HEK Zellen haben dabei gezeigt, dass dimere 13A7-Formate P2X7 in vitro effektiver inhibieren als monomere 13A7-Nanobodies. In vivo, nach intravenöser Injektion, zeigten ebenfalls die dimeren Konstrukte deutlich potentere Blockadeeigenschaften im Vergleich zu dem Monomer. So führte beispielsweise eine einmalige Injektion von 100µg 13dimAlb oder 13A7mFc zu einer bis zu 7 Tagen dauernden P2X7-Blockade auf CD4+ T-Zellen der Milz und auf Makrophagen aus dem Peritoneum. Beide Konstrukte waren zudem noch 7 Tage nach Injektion im Serum nachweisbar. Neben der Charakterisierung der 13A7-Konstrukte wurde zudem ein Fc-Fusionsprotein eines weiteren P2X7-blockierenden Nanobody-Klons (1c81) generiert und in vitro bezüglich der P2X7-Blockadeeigenschaften untersucht. Auch hier zeigte die Dimerisierung eine Verbesserung der Blockadeeigenschaften im Rahmen von in vitro Untersuchungen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit liefern somit wichtige Erkenntnisse für weitere in vivo Anwendungen wie z.B. für die Evaluation der P2X7-Nanobodies in Entzündungsmausmodellen. Zum anderen wurden bereits verfügbare Nanobodies weiterentwickelt um sie für die zukünftige in vivo Anwendung zu optimieren.
Kurzfassung auf Englisch: The immune system responds to body-borne pathogens such as bacteria or viruses with triggering of an immune response. In addition, the immunsystem is able to react to sterile tissue damage. Furthermore the release of intracellular adenosine triphosphate (ATP) into the extracellular space, whether as a result of infection or traumatic tissue damage, plays a central role as a danger signal for the immune system. ATP is a ligand for purine receptors, such as the P2X7-receptor, which at the cellular level releases the pro-inflammatory cytokine interleukin 1β (IL-1β). In order to be able to suppress P2X7-mediated inflammatory processes therapeutically, single-domain antibodies, also known as nanobodies, had been developed against this ion channel previously in the Nolte lab at the Institute of Immunology of the UKE (W. Danquah et al., 2016; W Danquah, 2012). Nanobodies are antibody fragments which function as the smallest antigen binding unit. Due to their small size and exceptional structure, they have the ability to penetrate deep into tissues and are capable of binding to structures that are difficult to reach for conventional antibodies. Therefore they may inhibit or enhance the function of enzymes or ligand-controlled ion channels, e.g. P2X7. Within the scope of these studies, the pharmacological properties of various formats of P2X7-blocking nanobodies 13A7 were investigated in vitro as well as in vivo. In this certain study, 13A7-monomers, heterotrimers consisting of two 13A7-monomers and one anti-albumin-nanobody (named 13A7dimAlb), as well as 13A7-Fc-fusion proteins (named 13A7mFc) were compared. Initial experiments with P2X7-expressing HEK-cells have shown that dimeric 13A7 formats inhibit P2X7 in vitro more effectively than monomeric 13A7-nanobodies. In vivo, after intravenous injection, the dimeric constructs have also shown significantly more potent blockade properties compared to the monomer. For example, a single injection of 100μg 13dimAlb or 13A7mFc resulted in a P2X7-blockade lasting up to seven days on CD4+ T-cells of the spleen and on macrophages from the peritoneum. Both constructs have been also detectable seven days after injection in the serum. In addition to the characterization of the 13A7-constructs, an Fc-fusion protein of a further P2X7-blocking nanobody-clone (1c81) was generated and tested in vitro for P2X7-blockade properties. Here too, the dimerization has shown an improvement in the blocking properties in the context of in vitro investigation. The results of this dissertation thus provide important insights for further in vivo applications, e.g. for the evaluation of P2X7-nanobodies in inflammation models. Furthermore, already available nanobodies were optimized to for future in vivo application.

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