Developmental and adult expression of Arc/Arg3.1 in corticolimbic structures determines memory and emotional control

Abstract

The corticolimbic circuitry plays a central role in memory and emotions, two strongly interlinked functions of the brain. While plasticity in this circuitry is considered essential for memory consolidation, its role in emotion regulation remains unclear. Moreover, synaptic plasticity during early postnatal development shapes the connectivity within this circuit, yet its impact on either of these functions remains elusive. In this thesis, I sought to address these questions by disrupting plasticity in the corticolimbic circuitry, mediated by the activity-regulated cytoskeleton-associated protein / activity-regulated gene of 3.1 kb (Arc/Arg3.1), in a time and location dependent manner.

Arc/Arg3.1 is rapidly induced by acquisition of experience and synaptic plasticity-producing stimuli and is in turn essential for consolidation of long-term memories and synaptic plasticity. Strong upregulation of Arc/Arg3.1 in the corticolimbic circuitry of adult mice subjected to fearful experience and its presence during early postnatal development make it a strong candidate for disrupting plasticity mechanisms in the developing, as well as in the adult brain. In this study, I employed an Arc/Arg3.1 floxed mouse line (Arc/Arg3.1f/f), engineered in our lab, together with Cre-mediated recombination to achieve spatio-temporal removal of Arc/Arg3.1. By in situ radioactive hybridization and immunohistochemistry, I analyzed Arc/Arg3.1 expression in wild-type and mutant animals, and assessed memory and emotional behaviors with specialized behavioral tests. In vivo field recordings and magnetic resonance imaging (MRI) were used to study functional and structural modifications of corticolimbic networks.

In the first part of this thesis, I quantified the expression profile of Arc/Arg3.1 mRNA in the brain across the first postnatal month and evaluated the impact of removing the gene within this developmental period. Arc/Arg3.1 mRNA expression begins early during postnatal development in the cornus ammonis 3 (CA3) region of the hippocampus and in the olfactory bulb, increases sharply after the second week in the rest of corticolimbic and sensory structures and diminishes slowly in cortical regions to low levels in the nonstimulated adult brain. Thus, Arc/Arg3.1 bears the potential to impact postnatal brain development and thereby its loss might cause a later disturbance of long-term memory consolidation and emotion regulation. To address this possibility, Arc/Arg3.1f/f mice were bred with CaMKIIα-iCre carrying mice to obtain progeny in which the Arc/Arg3.1 gene was ablated in principal neurons during the second postnatal week (Early-cKO). Behavioral assessment confirmed a strong impairment in the consolidation of explicit and implicit long-term memories and in vivo local field recordings showed strong deficits in memory-linked activity, alteration of hippocampal sharp-wave ripples and of oscillatory activity in the prefrontal cortex (PFC). Additionally, and unlike constitutive KO mice, Early-cKO mice exhibited a significantly enhanced learning of aversive stimuli and strong anxiolytic-like phenotype. MRI analysis demonstrated an altered morphology of the CA3, fimbria and lateral septum. Resting state funtional (rsfMRI) revealed specific disruption of the functional connectivity in cortico-PFC and hippocampaldiencephalic circuits, both of which play a central role in memory, decision making and emotional control. These results demonstrate, for the first time, the participation of Arc/Arg3.1 in shaping developmental connectivity of corticolimbic networks and also suggest that emotional dysregulation might arise from an imbalance in the Arc/Arg3.1-mediated plasticity among structures that express the gene at different time points during early postnatal development.

In the second part of this thesis, I evaluated the importance of Arc/Arg3.1 expression in specific hubs of the corticolimbic circuitry for fear memory and anxiety, by employing stereotactic delivery of Cre-carrying viral vectors to the brain of Arc/Arg3.1f/f adult mice. Behavioral assessment showed that Arc/Arg3.1 expression in the basolateral amygdala is essential for the consolidation of auditory fear conditioning, thus confirming its role in memory formation. In contrast, removal of Arc/Arg3.1 from the hippocampus and the anterior cingulate cortex (ACC) only modulated the acquisition of fear and unconditioned avoidance, respectively. These results confirm that Arc/Arg3.1 plays an essential role in the consolidation of long-term implicit fear memory and modifies anxiety in adulthood. Furthermore, imbalanced Arc/Arg3.1-mediated plasticity among regions participating in this circuitry might cause an emotional dysregulation even in adulthood.

This work provides new evidence that reaffirms the essential participation of the synaptic plasticity gene Arc/Arg3.1 in the consolidation of long-term fear memory. It highlights for the first time its contribution to sensitive periods of emotional behavior and to functional connectivity within the corticolimbic circuitry. This novel role of Arc/Arg3.1 implies its importance in the pathophysiology of neurodevelopmental and fear-related disorders, and paves the way to study the interaction of Arc/Arg3.1 with environmental risk factors during sensitive periods for neuropsychiatric disorders.

Das neuronale Netzwerk der cortico-limbischen Hirnareale spielt eine zentrale Rolle für die Generierung von Gedächtnis und Emotionen, zwei stark miteinander verbundene Gehirnfunktionen. In diesem Netzwerk wird die synaptische Plastizität als essentieller Bestandteil zur Konsolidierung des Langzeitgedächtnisses angesehen. Es ist jedoch unbekannt, ob diese zelluläre Funktion auch für die Emotionsregulation notwendig ist. Darüber hinaus formt die synaptische Plastizität während der frühen postnatalen Entwicklung die Konnektivität innerhalb dieses Netzwerkes, ihre Notwendigkeit während dieser Phase zur Ausbildung der Gehirnfunktionen ist bisher jedoch unklar. In dieser Doktorarbeit adressiere ich diese Fragen mit Hilfe der gezielten, zeit- und ortsabhängigen, konditionalen Störung der Arc/Arg3.1-vermittelten Plastizität im cortico-limbischen System.

Die Expression des aktivitätsregulierten Gens Arc/Arg3.1 wird durch plastizitätsinduzierende Stimuli und das Erlernen neuer Erfahrungen schnell hochreguliert. Die konstitutive Deletion des Arc/Arg3.1 Gens in Mäusen verursacht schwere Störungen in der Konsolidierung hippocampaler synaptischer Plastizität und führt zur Beeinträchtigung des expliziten und impliziten Langzeitgedächtnisses. Während der frühen postnatalen Entwicklung und nach dem Erfahren von Angst in erwachsenen Mäusen kommt es zur starken Hochregulation von Arc/Arg3.1 im corticolimbischen System. Daher erscheint die konditionale Ausschaltung der Arc/Arg3.1-Expression neue Erkenntnisse über die Plastizitätsmechanismen im sich entwickelnden und im adulten Gehirn zu erlauben. In dieser Dissertation verwende ich eine, in unserem Labor generierte, LoxP-flankierte Arc/Arg3.1 Mauslinie (Arc/Arg3.1f/f) in Kombination mit Cre-vermittelter Rekombination, um eine orts- und zeitabhängige Entfernung des Arc/Arg3.1 Gens zu erzielen. Der Verlust der Arc/Arg3.1-Expression im Gehirn wurde mittels in situ-Hybridisierung und Immunohistochemie nachgewiesen. Zur Analyse des Gedächtnisses und des Emotionalverhaltens habe ich spezifische Verhaltensexperimente durchgeführt. Des Weiteren wurden in vivo Feldpotenzialmessungen und die Magnetresonanztomographie (MRT) angewendet, um funktionelle und strukturelle Modifikationen im cortico-limbischen System zu identifizieren.

Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich die Expression der Arc/Arg3.1 mRNA während des ersten postnatalen Monats quantifiziert und die Auswirkung des Verlustes von Arc/Arg3.1 ab dieser Entwicklungsphase evaluiert. Die Expression der Arc/Arg3.1 mRNA beginnt während der frühen postnatalen Entwicklung in der Cornu Ammonis 3 (CA3)-Region des Hippocampus und dem Bulbus Olfaktorius. Nach der zweiten Woche steigt sie in den restlichen cortico-limbischen und sensorischen Arealen stark an und pendelt sich letztlich in kortikalen Regionen langsam auf einem schwachen Niveau ein. Daher besitzt Arc/Arg3.1 das Potential, die postnatale Entwicklung des Gehirns zu beeinträchtigen und dadurch die Konsolidierung des Langzeitgedächtnisses und die Regulation von Emotionen im adulten Tier zu stören. Um diese Möglichkeit zu erforschen, wurde die Arc/Arg3.1f/f Mauslinie mit einer CaMKII-iCre Mauslinie gekreuzt, wodurch Arc/Arg3.1 in der zweiten Woche der postnatalen Entwicklung ausschließlich in prinzipalen Neuronen entfernt wurde (Early-cKO). Mithilfe von Verhaltensversuchen konnte ich die schweren Konsolidierungsstörungen des expliziten und impliziten Langzeitgedächtnisses in diesen Mäusen bestätigen. In vivo Messungen der Feldpotentiale zeigen darüber hinaus starke Veränderungen der Gedächtnis-assoziierten Aktivität, der sharp wave-ripple Komplexe sowie der Oszillationen im Präfrontalen Cortex (PFC). Zusätzlich, und im Unterschied zur konstitutiven KO-Mauslinie, zeigen die Early-cKO Mäuse ein signifikant verbessertes Lernen nach aversiven Stimuli und ein stark vermindertes Angstverhalten. Die Magnetresonanzanalyse zeigt Veränderungen der grauen Substanz in der CA3-Region, der Fimbria, des lateralen Septums und der funktionellen Konnektivitäten zwischen Arealen des PFCs sowie Hippocampus und Habenula, die beide mit Gedächtnis, Emotionsregulation und Entscheidungsprozessen in Verbindung gebracht werden. Diese Befunde zeigen zum ersten Mal, dass Arc/Arg3.1 in einer sensitiven Periode der Entwicklung an der Ausbildung der funktionalen Konnektivität von cortico-limbischen Netzwerken beteiligt ist. Dies weist darauf hin, dass diese Emotionsdysregulation aus einem gestörten Gleichgewicht der Arc/Arg3.1-vermittellten Plastizität zwischen Regionen des cortico-limbischen Systems folgen könnte, in denen das Gen während der postnatalen Entwicklung in einem differenzierten zeitlichen Muster exprimiert wird.

Im zweiten Teil dieser Dissertation habe ich die Rolle von Arg/Arg3.1 für das emotionale Gedächtnis und das Angstverhalten im Zusammenhang mit den zuvor identifizierten, zentralen corticolimbischen Schnittstellen untersucht. Zu diesem Zweck wurde Viren zur Expression der CreRekombinase und damit zum Ausschalten von Arc/Arg3.1 stereotaktisch in zentrale Areale des neuronalen Angstnetzwerks injiziert. Die anschließende Untersuchung des Verhaltens zeigte, dass die Expression von Arg/Arg3.1 in der basolateralen Amygdala für die Konsolidierung der auditorischen Angstkonditionierung notwendig ist. Darüber hinaus hat die Arc/Arg3.1-Expression im Hippocampus und anterioren cingulären Cortex (ACC) nur eine modulierende Funktion beim Erlernen der Angstkonditionierung, beziehungsweise des Angstverhaltens. Diese Ergebnisse zeigen, dass Arc/Arg3.1 eine zentrale Rolle bei der Konsolidierung des impliziten Langzeitangstgedächtnisses spielt und das Angstverhalten in erwachsenen Tieren modulieren kann.

Diese Arbeit untermauert die entscheidende Rolle des synaptischen Plastizitäts-Gens Arg/Arg3.1 bei der Konsolidierung des Langzeitgedächtnisses und zeigt zum ersten Mal seine Beteiligung an einer sensitiven Phase der Entwicklung des Emotionalverhaltens und der funktionalen Hirnkonnektivität des cortico-limbischen Netzwerks. Diese neue Funktion von Arc/Arg3.1 deutet auf dessen Bedeutung bei der Pathophysiologie von Entwicklungsstörungen des Nervensystems und bei Angststörungen hin. Diese Befunde ebnen den Weg für weitere Analysen der Funktion von Arc/Arg3.1 in Entwicklungsprozessen und zeigen die entscheidende Rolle der Wechselwirkungen von Arc/Arg3.1 mit Umweltrisikofaktoren während der für neuropsychiatrische Störungen sensitiven Entwicklungsphase.