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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-93680
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9368/


Multispecific substrate recognition in a Proton-Dependent Oligopeptide Transporter

Multispezifische Substraterkennung in einem Proton-abhängigen Oligopeptid-Transporter

Martínez Molledo, María

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Basisklassifikation: 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Löw, Christian (Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.09.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 11.01.2019
Kurzfassung auf Englisch: Proton-dependent oligopeptide transporters (POTs) are members of the major facilitator superfamily (MFS) of transporters, one of the largest transporter families in nature. They are widely distributed in all evolutionary lineages, also with representatives in humans. POTs have been typically described as highly promiscuous transporters, as they move di- and tripeptides across the membrane independently of their amino acid composition. Furthermore, humans POTs are also involved in drug absorption and thus have great pharmacological significance. Previous to our studies, there were very few reported structures of bacterial POTs in complex with natural ligands. Furthermore, these ligands presented poor variability in terms of physicochemical features and therefore, we aimed to explore how substrates with different characteristics can bind to these transporters.

Here we present a screening method to identify potential ligands for the bacterial POT from Streptococcus thermophilus (PepTSt) as well as its characterization by microscale thermophoresis (MST). We established a workflow that firstly involved the screening of a library of different di- and tripeptides by differential scanning fluorimetry (DSF). The potential substrates for PepTSt were identified as they increased the stability of the transporter. We observed that PepTSt favorably binds dipeptides over tripeptides, especially those with non-polar residues and polar but not charged side chains. We further characterized the identified ligands by MST, determining the KD values for individual di- and tripeptides. The resulting affinities for the measured ligands were in the millimolar range. Finally, this information was used to obtain crystallographic structures of PepTSt in complex with chemically diverse ligands using the lipidic cubic phase (LCP) crystallization method. In total we determined nine X-ray crystallographic structures of PepTSt (resolution range of 2.0-2.7 Å) in complex with natural peptide ligands (Ala-Leu, Ala-Gln, Asp-Glu, Phe-Ala and the tripeptide Phe-Ala-Gln), non-peptidic substrates (phosphate ions and HEPES molecule) and an apo structure.

From the structures of PepTSt in complex with the peptidic ligands, we conclude that the coordination of the peptides from the N- and C-termini is conserved but we also realized that these are not the only relevant interactions to bind a substrate in PepTSt. As a result, the main principles of substrate binding in PepTSt were established as follows: (1) Dipeptides can place their peptide backbone at least in two different positions in the binding cavity. (2) The size of the PepTSt binding cavity can be fine-tuned by the highly conserved residue Tyr-68. (3) The solvation state changes in the binding cavity upon ligand binding and water molecules play an important role in ligand coordination. (4) Tripeptide binding was only observed for peptides with Phe-Ala-Xxx sequence, which is enabled by the bending of the peptide backbone in the middle position to fit into the reduced size of the binding cavity.

In conclusion, our studies shed light on the molecular mechanisms of peptide recognition and binding in bacterial POTs, which can be extrapolated to other members of the family due to the high conservation of the binding site residues among POT transporters. Furthermore, we have now established a workflow for the study of peptide binding in solution, which is applicable to other members of this transporter family.
Kurzfassung auf Englisch: Protonen-abhängige Oligopeptidtransporter (POTs) gehören zur Gruppe der Major Facilitator Superfamily (MFS) Transporter, die eine der größten Transporter Proteinfamilien in der Natur darstellt. POTs sind weit verbreitet in allen evolutionären Abstammungslinien und kommen auch im Menschen vor. Sie sind typischer Weise als sehr substrat-unspezifisch beschrieben worden, weil sie Di- und Tripeptide unabhängig von ihrer Aminosäurezusammensetzung durch die Zellmembran transportieren können. Darüber hinaus sind POTs im Menschen auch bei der Aufnahme von Medikamenten beteiligt und sind daher von hoher pharmakologischer Bedeutung. Vor Beginn meiner Studien waren wenige Röntgenkristallstrukturen von POTs in Verbindung mit natürlichen Substraten beschrieben worden. Die verwendeten Ligandsubstrate repräsentieren zudem eine geringe Variabilität in Beziehung auf ihre physikochemischen Eigenschaften und ein Ziel meiner Arbeit war es daher herauszufinden, wie Substrate mit verschieden Eigenschaften an diese Transporter binden können.

In meiner Arbeit beschreibe ich eine Screening-Methode um potenzielle Substrate eines bakteriellen POT aus Streptococcus theromophilus (PepTSt) zu identifiezieren, sowie die Charakterisierung dieses Transporters mittels Microscale Thermophoresis (MST). Es wurde ein Workflow etabliert, der im ersten Schritt ein Screening einer Bibliothek von verschiedenen Di- und Tripeptiden mittels Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF) beinhaltet. Die potentiellen Substrate für PepTSt konnten durch die Erhöhung der Stabilität des Transporters identifiziert werden. Beim Vergleich zwischen Di- und Tripeptiden konnte beobachtet werden, dass PepTSt, Dipeptide bevorzugt bindet, und vor allem solche Peptidketten, die unpolare Aminosäuren und polare, nicht-geladene Seitenketten besitzen. Die identifizierten Ligandsubstrate konnten mittels MST Methodik weiter charakterisiert werden, um KD Enzymkonstanten für individuelle Di- und Tripeptide zu bestimmen. Die ermittelten Affinitäten für die gemessenen Liganden waren im millimolaren Bereich. Diese Information wurde im letzten Schritt dazu benutzt um kristallographische Strukturen von PepTSt in Verbindung mit chemisch-diversen Liganden mittels Lipidic Cubic Phase (LCP) Kristallographie zu bestimmen. Insgesamt konnten dadurch acht individuelle Röntgenkristallstrukturen mit einer Auflösung von 2.0 – 2.7 Å bestimmt werden und beinhalten Kristallstrukturen in Verbindung mit natürlichen Peptidliganden (Ala-Leu, Ala-Gln, Asp-Glu, Phe-Ala, Phe-Ala-Gln), Strukturen in Verbindung mit nicht-Peptid Puffersubstraten (Phosphationen, HEPES Molekül) und eine Apoproteinstruktur.
Anhand der Struktur von PepTSt in Verbindung mit Peptidliganden können wir rückschließen, dass die N- und C-terminale Koordination der Peptide in der Bindefalte konserviert ist, aber wir können auch feststellen, dass diese Koordination nicht die einzige relevante Wechselwirkung für die Bindung eines Substrates durch PepTSt ist. Es wurden infolgedessen die folgenden Hauptprinzipien der Substratbindung durch PepTSt wie folgt etabliert: (1) Das Rückgrat von Dipeptiden kann in mindestens zwei verschieden Positionen in der Bindefalte untergebracht werden. (2) Die Größe der PepTSt Bindefalte kann durch den hochkonservierten Aminosäurerest Tyr-68 feinreguliert werden. (3) Der Grad der Solvatisierung der Bindefalte verändert sich im Zuge der Bindung eines Liganden und Wassermoleküle spielen eine Rolle bei der Koordination eines Liganden. (4) Die Bindung von Tripeptiden konnte nur für Peptide mit Phe-Ala-Xxx Sequenzen beobachtet werden und wird durch die Krümmung der Peptidkette in der mittleren Position gewährleistet, wodurch das Peptidmolekül an die kleine Bindefalte angepasst werden kann.

Insgesamt konnten meine Untersuchungen neue Einsichten in die molekularen Mechanismen der Erkennung von Peptiden durch bakterielle protonen-abhängige Oligopeptidtransporter (POTs) liefern, die auf Grundlage der hohen Konservierung der Bindestellen von POTs extrapoliert, und auf andere Mitglieder dieser Proteinfamilie angewendet werden können. Darüber hinaus konnte ein Workflow für die Untersuchung der Peptidbindung in Lösung etabliert werden, der sich auf andere Mitglieder dieser Transporter-Proteinfamilie anwenden lässt.

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