Expression, modulation and function of the P2X7 receptor on human immune cells

Abstract

Injured and dying cells release large amounts of adenosine triphosphate (ATP) to the extracellular milieu, which is recognized as a danger signal by the immune system. Released ATP engages purinergic receptors, such as P2X7, promoting inflammation. Extracellular ATP is exposed to degradation, therefore ATP and its downstream metabolites may trigger contrasting responses by signalling through different purinergic receptors. P2X7 is expressed in most human tissues and immune cells. ATP binding activates P2X7 and induces the influx of Ca2+ and Na+ and efflux of K+, triggering distinct cellular responses depending on the cell type. Persistent stimulation by ATP induces the opening of a non-selective pore permeable to organic cationic molecules, and ultimately leads to cell death. In monocytes, P2X7 activation results in the activation of the inflammasome and subsequent processing of the proinflammatory cytokines IL-1β and IL-18. IL-1β is pivotal for host immune response against pathogens, but is also associated with exacerbated inflammatory responses. Experiments performed in P2X7-deficient animal models and using pharmacological blockers have demonstrated that P2X7 plays a key role in autoinflammatory and autoimmune diseases, highlighting its potential as a target for therapy.

While in mice P2X7 is prominently expressed on regulatory T cells (Tregs) and invariant natural killer cells (iNKTs); we found that in human peripheral blood, innate-like lymphocytes (ILLs) express the highest levels of P2X7 among lymphocytes, and are the most sensitive to ATP. ILLs exhibit properties from both innate and adaptive immunity and, in contrast to conventional T cells, become rapidly activated upon antigen encounter. Activated and effector T cells also show higher expression of P2X7 and sensitivity to ATP than naïve T cells. These data suggest a role of P2X7 as a “checkpoint” to limit excessive effector immune responses. We also demonstrated the high specificity of Dano1 for blocking P2X7-mediated cellular responses in all immune cells. Dano1 efficiently inhibited activation of the inflammasome and release of IL-1β in a surrogate model of inflammation with LPS. Remarkably, Dano1 exhibited up to 2000-fold higher potency in preventing release of IL-1β than small-molecule antagonists currently in preclinical development.

In conclusion, we proved the potential of the P2X7-specific nanobody Dano1 for blocking P2X7 function in humans, underlining Dano1 as a promising drug candidate for the treatment of human inflammatory diseases. Since we observed higher expression of P2X7 on the surface of proinflammatory T helper (Th) subsets, we postulate that Dano1 could also be a potential therapy against Th1 and Th17 cell-driven diseases; not only by reducing IL-1β production but also by directly modulating the function of T cells.

Absterbende und gestresste Zellen geben große Mengen an Adenosintriphosphat (ATP) in den extrazellulären Raum ab, welches dort vom Immunsystem als Gefahrensignal erkannt wird. Freigesetztes ATP bindet an purinerge Rezeptoren, wie zum Beispiel P2X7, und wirkt auf diesem Wege entzündungsfördernd. Extrazelluläres ATP kann in unterschiedliche Metabolite abgebaut werden, die wiederum an andere purinerge Rezeptoren binden und teilweise antagonistische Immunantworten auslösen. P2X7 wird in den meisten humanen Geweben und Immunzellen exprimiert. ATP aktiviert P2X7 und induziert damit den Influx von Ca2+ und Na+, sowie den K+ efflux. Damit werden, in Abhängigkeit vom Zelltyp verschiedene Reaktionen ausgelöst. Anhaltende Stimulation durch ATP induziert das Öffnen von nichtselektiven Zellporen, durchgängig für organische, kationische Moleküle, was letztendlich zum Zelltod führt. In Monozyten vermittelt die Aktivierung von P2X7 die Aktivierung von Inflammasomen und damit einhergehend die Prozessierung von entzündungsfördernden Zytokinen, wie IL-1β und IL-18. IL-1β ist entscheidend für die Immunantwort gegen Pathogene, aber auch assoziiert mit einer Verschärfung der Entzündungsreaktion. Experimente in P2X7-defizienten Tiermodellen und der Gebrauch von pharmakologischen Antagonisten konnte zeigen, dass P2X7 eine Schlüsselrolle bei der Vermittlung von autoentzündlichen Reaktionen und Autoimmunerkrankungen spielt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Rolle von P2X7 als potentielles Zielmolekül für Therapien.

Während P2X7 in der Maus primär von regulatorischen T-Zellen (Tregs) und invarianten natürlichen Killerzellen (iNKTs) exprimiert wird, konnten wir zeigen, dass in humanem peripheren Blut innate-like lymphocytes (ILLs), verglichen mit anderen Lymphozyten, die höchste P2X7-Expression aufweisen und am empfindlichsten auf ATP reagieren. ILLs weisen sowohl Eigenschaften von Zellen des angeborenen als auch des erworbenen Immunsystems auf. Anders als konventionelle T-Zellen werden ILLs unverzüglich nach Antigenkontakt aktiviert. Aktivierte und Effektor T-Zellen zeigten im Vergleich zu naiven T-Zellen ebenfalls eine höhere P2X7-Expression und Empfindlichkeit gegenüber ATP auf. Diese Daten legen nahe, dass P2X7 als Kontrollpunkt zur Limitierung von ausufernden Immunantworten dient. Wir konnten ebenfalls zeigen, dass Dano1, ein therapeutischer Nanobody gegen P2X7, die P2X7-vermittelten zellulären Antworten in allen Immunzellen spezifisch blockiert. In einem LPS-Entzündungsmodell inhibierte Dano1 die Aktivierung von Inflammasomen und die Ausschüttung von IL-1β sehr effizient. Bemerkenswerterweise zeigte Dano1 dabei eine zweitausendfach höhere Wirkung bei der Inhibierung der Zytokinausschüttung als niedermolekulare Antagonisten aus der aktuellen präklinischen Entwicklung.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass der P2X7-spezifische Nanobody Dano1 ein hohes Potential besitzt, die Funktion von P2X7 in humanen Zellen zu blockieren. Diese Ergebnisse unterstreichen Dano1 als einen vielversprechenden Kandidaten für die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen im Menschen. Da wir eine höhere Expression von P2X7 auf der Oberfläche von entzündungsfördernden Untertypen der T-Helfer-Zellen zeigen konnten, postulieren wir, dass Dano1 auch potentiell für die Behandlung von TH1- und TH17-Zell-vermittelten Krankheiten therapeutisch eingesetzt werden könnte; nicht nur durch die Reduzierung der IL-1β Produktion, sondern auch direkt durch Modulation der T-Zellfunktion.