Volltextdatei(en) vorhanden
Titel: DNA-Aptamere : Selektion und Anwendung zum spezifischen Nachweis von AB5-Toxinen
Sonstige Titel: DNA Aptamers : Selection and application for specific detection of AB5 toxins
Sprache: Deutsch
Autor*in: Frohnmeyer, Esther
Schlagwörter: Aptamer; SELEX; Choleratoxin; Shigatoxin 1; Enzyme-linked Aptamer Assay; Lateral Flow Assay; Aptamer; SELEX; Cholera toxin; Shiga toxin 1; Enzyme-linked Aptamer Assay; Lateral Flow Assay
Erscheinungsdatum: 2019
Tag der mündlichen Prüfung: 2019-04-05
Zusammenfassung: 
Das von Vibrio cholerae produzierte Choleratoxin ist der Auslöser der schweren Durchfallerkrankung Cholera, an welcher jährlich mehrere Millionen Menschen erkranken. Das Shiga-like Toxin 1, Shigatoxin 1 oder Verotoxin 1 wird von Shigatoxin-bildenden Escherichia coli produziert, welche unter anderem das hämolytisch-urämische Syndrom auslösen können. Beide Toxine sind aus einer monomeren A-Untereinheit und fünf ein Pentamer bildenden B-Untereinheiten aufgebaute AB5-Toxine.
In der vorliegenden Arbeit wurden Aptamere, kurze einzelsträngige Nukleinsäuren, die durch ihre Faltung spezifisch an Zielmoleküle binden können und daher in der Analytik als Antikörperalternativen eingesetzt werden, mittels Just in Time-Selection gegen das B-Pentamer des heterolog exprimierten Choleratoxins (CT-B) und Shigatoxins 1 (ST1-B) selektiert und charakterisiert.
Das sehr affine und selektive Choleratoxin-Aptamer CT916 (KD = 48,5 nM bzw. 66,1 nM) wurde in Kombination mit Antikörpern zur Entwicklung eines Magnetpartikel-basierten Sandwich Enzyme-linked Aptamer Assays eingesetzt, mit welchem Choleratoxin mit einer Nachweisgrenze von 2,1 ng/ml bzw. 2,4 ng/ml in dotiertem Puffer bzw. dotiertem Leitungswasser nachgewiesen werden konnte. Weiterhin wurden vier verschiedene Lateral Flow Assays entwickelt; (i) ein auf Kompetition mit immobilisiertem CT-B beruhender kompetitiver Assay mit Detektor-Aptamer und einer Nachweisgrenze von 51 ng/ml, (ii) ein einfaches Sandwich mit einem Fänger-Antikörper und Detektor-Aptamer mit einer Nachweisgrenze von 5 ng/ml, (iii) ein mobiles Sandwich mit zwei Fänger-Antikörpern und einem Detektor-Aptamer und einer Nachweisgrenze von 0,6 ng/ml, sowie (iv) ein Sandwich mit Fänger-Aptamer und GM1-Rezeptor-modifizierten Liposomen als Detektor mit einer Nachweisgrenze von 2 ng/ml in Puffer.
Das Shigatoxin 1-Aptamer ST1076 (KD = 14,7 nM) wurde zusammen mit den Shigatoxin 1-spezifischen Glykoproteinen des Taubeneiweißes zur Entwicklung eines Magnetpartikel-basierten Sandwich Enzyme-linked Aptamer Assays verwendet, mit dem Shigatoxin 1 in dotiertem Puffer, fettfreier und fettarmer Milch sowie Hackfleisch mit Nachweisgrenzen von 105,4 ng/ml, 270,8 ng/ml, 414,2 ng/ml und 269,6 ng/ml nachgewiesen werden konnte.
Zusätzlich wurden die Cholera- bzw. Shigatoxin 1-Aptamere CT916 und ST1065 (KD = 26,9 nM) in einer weiteren biotechnologischen Anwendung erfolgreich zur Affinitätsanreicherung von CT-B und ST1-B aus Zellpellets eingesetzt.
Zuletzt wurden Kleinwinkelröntgenstreuungsexperimente (small angle X-ray scattering) zur Aufklärung der Struktur des Aptamers CT916 und zur Untersuchung seiner Bindungsstelle an CT-B durchgeführt.

Cholera toxin produced by Vibrio cholerae is the causative agent of the eponymous severe diarrheal disease, which affects several million people every year. Shiga-like toxin 1, Shiga toxin 1 or Verotoxin 1 is secreted by Shiga toxin producing Escherichia coli, which can cause haemolytic uremic syndrome amongst others. Both are AB5 toxins composed of a monomeric A subunit and five pentamer-forming B subunits.
In the present study, aptamers, short single-stranded nucleic acids, which by their folding can specifically bind to target molecules and are therefore used in analytics as antibody alternatives, were selected by Just in Time-selection against the B pentamers of the heterologously expressed cholera toxin (CT-B) and Shiga toxin 1 (ST1-B) and thoroughly characterized.
The highly affine and selective cholera toxin aptamer CT916 (KD = 48.5 nM and 66.1 nM, respectively) was used in combination with antibodies to develop a magnetic bead-based sandwich enzyme-linked aptamer assay with a detection limit of 2.1 ng/ml and 2.4 ng/ml for cholera toxin detection in spiked buffer and tap water, respectively. Furthermore, four different lateral flow assays were developed; (i) a competitive assay with immobilized CT-B and a detector aptamer having a detection limit of 51 ng/ml, (ii) a simple sandwich with a capture antibody and detector aptamer having a detection limit of 5 ng/ml, (iii) a mobile sandwich with two capture antibodies and a detector aptamer having a detection limit of 0.6 ng/ml, as well as (iv) a sandwich with capture aptamer and GM1 receptor-modified liposomes as detector having a detection limit of 2 ng/ml in buffer.
The Shiga toxin 1 aptamer ST1076 (KD = 14.7 nM) was used in combination with Shiga toxin 1 specific pigeon egg white glycoproteins for the development of a magnetic bead-based sandwich enzyme-linked aptamer assay, which was capable of Shiga toxin 1 detection in spiked buffer, low and medium fat milk and ground beef at detection limits of 105.4 ng/ml, 270.8 ng/ml, 414.2 ng/ml and 269.6 ng/ml, respectively.
In addition, the cholera and Shiga toxin 1 aptamers CT916 and ST1065 (KD = 26.9 nM) were successfully used in another biotechnological application for the affinity enrichment of CT-B and ST1-B from cell pellets.
Finally, small-angle X-ray scattering experiments were performed to elucidate the structure of aptamer CT916 and study its binding site to CT-B.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8151
URN: urn:nbn:de:gbv:18-97217
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Fischer, Markus (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

Dateien zu dieser Ressource:
Datei Beschreibung Prüfsumme GrößeFormat  
Dissertation.pdf1187cd3a5667374298b5f31ba6300f796.88 MBAdobe PDFÖffnen/Anzeigen
Zur Langanzeige

Diese Publikation steht in elektronischer Form im Internet bereit und kann gelesen werden. Über den freien Zugang hinaus wurden durch die Urheberin / den Urheber keine weiteren Rechte eingeräumt. Nutzungshandlungen (wie zum Beispiel der Download, das Bearbeiten, das Weiterverbreiten) sind daher nur im Rahmen der gesetzlichen Erlaubnisse des Urheberrechtsgesetzes (UrhG) erlaubt. Dies gilt für die Publikation sowie für ihre einzelnen Bestandteile, soweit nichts Anderes ausgewiesen ist.

Info

Seitenansichten

634
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 27.03.2024

Download(s)

484
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 27.03.2024
Werkzeuge

Google ScholarTM

Prüfe