Transkriptomgestützte Untersuchung des frühen Infektionsprozesses von Fusarium graminearum auf Weizen : Wildtyp 8/1 und ΔGpmk1 im Vergleich

Abstract

Der phytopathogene Ascomycet Fusarium graminearum befällt verschiedene wirtschaftlich genutzte Gräser wie Weizen, Gerste oder Mais. Dies führt zu erheblichen Verlusten durch Verringerung des Ernteertrags, da die Infektion zu einer Kontamination mit Mykotoxinen führt. Daher ist die Erforschung des Infektionsprozesses von F. graminearum von großem Interesse. In dieser Arbeit wurde dafür ein transkriptomgestützter Ansatz zum Vergleich des Wildtyps 8/1 und einer avirulenten Deletionsmutante der Gibberella Pathogenitäts-MAP-Kinase „ΔGpmk1“ von F. graminearum gewählt. Zunächst wurde hierfür Pilzmaterial von infizierten Weizenspelzen mittels Laser Capture Mikrodissektion isoliert. So wurden separat die nicht-invasiven Laufhyphen, welche zur Besiedlung der Pflanzenoberfläche dienen, und die komplexen mehrzelligen Infektionskissen, die vom Pilz für die mehrfache Penetration der pflanzlichen Zelle eingesetzt werden, gesammelt. Ebenfalls wurde Material einer axenisch angezogenen Myzelkultur für die folgende Analyse geerntet. Das Material der drei verschiedenen Zelltypen des Wildtyps 8/1 und der ΔGpmk1 wurde zur Erstellung von doppelsträngigen cDNA-Banken eingesetzt. Diese wurden anschließend mittels Illumina-Verfahren sequenziert und bioinformatisch ausgewertet. Die 13826 Gene von F. graminearum wurden anhand ihrer Regulation in paarweisen Vergleichen der Proben und ihrer Funktion eingeteilt. Dies zeigte maßgebliche Unterschiede in der Transkription verschiedener Gene, insbesondere in den Infektionskissen des Wildtyps 8/1 und der ΔGpmk1. Es konnten insgesamt sieben funktionelle Kategorien identifiziert werden, denen ein hoher Anteil durch differentiell regulierte Gene codierte Proteine angehörten. Diese Gruppen waren G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, Dehydrogenasen, Transporterproteine, Transkriptionsfaktoren, Proteine in Verbindung zu reaktiven Sauerstoffspezies, putative Effektorproteine und kohlenhydrataktive Enzyme. Durch den durchgeführten Vergleich konnten neun Kandidatengene ausgewählt werden, die in dieser Arbeit näher molekularbiologisch charakterisiert werden sollten. Hierfür wurden Deletions- und Überexpressionsmutanten dieser Gene im Wildtyp 8/1 und der ΔGpmk1 erstellt. Die individuelle Überexpression der beiden Regulatoren TRI6 und TRI10 des Sekundärmetabolit-Clusters der Trichothecene-Biosynthese in der ΔGpmk1 zeigte unterschiedliche Ergebnisse. Während die verstärkte Expression des TRI10 nur einen Effekt auf die Regulation eines Teils der Gene des Clusters besaß, führte die Überexpression des TRI6 unter anderem zu einer wiederhergestellten Deoxynivalenol-Synthese und gesteigerten Virulenz der ΔGpmk1. Die Deletion von vier in den Infektionskissen des Wildtyps 8/1 hochregulierten putativen Effektorproteinen konnte keinen Effekt auf die Virulenz von F. graminearum auslösen. Die Untersuchung eines gEgh16-ähnlichen Proteins zeigte, dass dieses einen erheblichen Einfluss auf die Pathogenität des Pilzes hat. Die Ausschaltung des codierenden Gens führte zu einer deutlich gesteigerten Virulenz auf einem nahezu infektionsresistenten Weizenkultivar. Eine fluoreszenzmikroskopische Betrachtung infizierter Weizenspelzen zeigte, dass die Frequenz, mit der Infektionsstrukturen gebildet werden, und die Größe dieser Strukturen bei der Mutante deutlich erhöht waren. Die Überexpression des Gens löste hingegen eine starke Begrenzung der Infektion von Weizen aus. Die nähere Untersuchung zeigte, dass die Entwicklung von Infektionsstrukturen bei dieser Mutante unter den getesteten Bedingungen nicht mehr stattfand. Zur Charakterisierung zweier Regulatoren des G-Protein-Signalwegs FgFlbA und FgFlbB wurden diese im Wildtyp 8/1 überexprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Proteine das vegetative Wachstum unter osmotischem und oxidativem Stress beeinflussen. Allerdings hatte nur FgFlbA einen Effekt auf die asexuelle Reproduktion des Pilzes. Das Protein FgFlbB besaß hingegen einen deutlichen Einfluss auf die Virulenz von F. graminearum. Die Überexpression löste eine Hypervirulenz auf dem resistenten Weizenkultivar aus. Eine fluoreszenzmikroskopische Untersuchung des durch die Mutante infizierten Pflanzenmaterials zeigte im Vergleich zum Wildtyp 8/1 ein wesentlich dichteres Laufhyphennetzwerk sowie stark vergrößerte Infektionsstrukturen. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass sich der Wildtyp 8/1 und die ΔGpmk1 auf transkriptioneller Ebene deutlich unterscheiden. Die Avirulenz der Deletionsmutante ist daher nicht auf die fehlerhafte Transkription weniger einzelner Gene, sondern einer grundlegenden Änderung des gesamten Transkriptionsprofils zurückzuführen. Dennoch konnte der transkriptomgestützte Vergleich des Wildtyps 8/1 und der ΔGpmk1 zur Identifizierung einzelner Gene mit einem Bezug zur Pathogenität von F. graminearum herangezogen werden.

The phytopathogenic ascomycete Fusarium graminearum infects various economically used grasses such as wheat, barley or corn. This results in significant losses by reducing crop yield as the infection leads to contamination with mycotoxins. Therefore, the study of the infection process of F. graminearum is of great interest. In this work, a transcriptome-based approach was used to compare wild-type 8/1 and an avirulent deletion mutant of the Gibberella pathogenicity MAP kinase "ΔGpmk1" of F. graminearum. First, fungal material was isolated from infected wheat husks by laser capture microdissection. Separately, non-invasive runner hyphae, used to colonize the plant surface, and the complex multicellular infection cushions, formed by the fungus for multiple penetration events of the plant cell, were collected. Also material of axenically cultivated mycelium culture was harvested for the following analysis. The material of the three different wild-type 8/1 and ΔGpmk1 cell types was used to construct double-stranded cDNA libraries. These were then sequenced by Illumina method and analyzed bioinformatically. The 13826 genes of F. graminearum were classified by their regulation in pairwise comparisons of the samples as well as by their function. This showed significant differences in the transcription of various genes, in particular in the infection cushions of the wild-type 8/1 and the ΔGpmk1. A total of seven functional categories were identified, which included a high proportion of proteins encoded by differentially regulated genes. These groups were G protein-coupled receptors, dehydrogenases, transporter proteins, transcription factors, proteins related to reactive oxygen species, putative effector proteins, and carbohydrate-active enzymes. The comparison made it possible to select nine candidate genes, which should be further characterized by molecular biological methods. For this purpose, deletion and overexpression mutants of these genes were generated in wild type 8/1 and the ΔGpmk1. Individual overexpression of the two regulators TRI6 and TRI10 of the secondary metabolite cluster of trichothecene biosynthesis in the ΔGpmk1 showed different results. While the increased expression of TRI10 had only an effect on the regulation of part of the cluster genes, the overexpression of TRI6 led inter alia to a restored deoxynivalenol synthesis and increased virulence of the ΔGpmk1. The deletion of four putative effector proteins upregulated in the wild type 8/1 infection cushions failed to induce any effect on the virulence of F. graminearum. Examination of a gEgh16-like protein showed that it has a significant influence on the pathogenicity of the fungus. The deletion of the encoding gene led to a significantly increased virulence on a nearly infection-resistant wheat cultivar.

A fluorescence microscopic examination of infected wheat floret leaves showed that the frequency with which infection structures are formed and the size of these structures were significantly increased in the mutant. In contrast, overexpression of the gene causes a strong reduction of the infection on wheat. Closer examination showed that the development of infection structures no longer took place under the conditions tested in this mutant. To characterize the two regulators of G protein signaling FgFlbA and FgFlbB, these were overexpressed in wild type 8/1. It could be shown that both proteins influence vegetative growth under osmotic and oxidative stress. Only the expression of FgFlbA had an effect on the asexual reproduction of the fungus. The protein FgFlbB, however, had a significant influence on the virulence of F. graminearum. The overexpression caused hypervirulence on the resistant wheat cultivar. A fluorescence microscopic examination of the plant material infected by the mutant showed a much denser network of runner hyphae compared to the wild type 8/1 as well as greatly enlarged infection structures. Taken together, these results show that the wild-type 8/1 and the ΔGpmk1 differ significantly at the transcriptional level. The avirulence of the deletion mutant is therefore not due to the erroneous transcription of a few individual genes, but a fundamental change in the entire transcriptional profile. Nevertheless, the transcriptome-based comparison of wild-type 8/1 and ΔGpmk1 could be used to identify individual genes related to the pathogenicity of F. graminearum.