Analysis of T Cell Activation Regulators in Autoimmune Hepatitis

Abstract

Autoimmune hepatitis (AIH) is a chronic inflammatory liver disease with unknown aetiology and pathogenesis. Highly activated T effector cells seem to play a central role in the immunopathogenesis of AIH by mediating the inflammatory immune responses in the liver. In this study, we hypothesise that altered expression of T cell co-stimulation or co-inhibition may account for the disproportionate T cell activation in AIH, leading to improper monitored T cell immune responses. The aim of this study was to analyse various intrinsic regulatory molecules of T cell activation in peripheral blood and in livers of patients with AIH. For this purpose, we investigated expression levels of CBL-B, CTLA-4, GRAIL, ICOS, ITCH, NEDD4, OX40, PD-1, PKCθ and TRAF6 in liver and blood of treatment-naive AIH patients (n= 42) and AIH patients under immunosuppressive treatment (n= 37) in comparison with healthy controls (n= 44), patients with other autoimmune-mediated liver diseases such as PBC (n= 13) or PSC (n=18), and with patients with non-autoimmune liver disorders such as DILI (n= 35) or NASH (n= 17). By use of quantitative real-time PCR screening, we identified that expression of CTLA-4, PD-1 and ICOS were significantly increased in liver tissue samples of treatment-naive AIH patients in comparison with control groups. Moreover, intrahepatic expression of CBL-B, PD-1 and CTLA-4 in AIH patients correlated positively with the modified hepatic activity index (mHAI) of these patients, suggesting that with an increase of intrahepatic disease activity, expression levels of CBL-B, CTLA-4, ICOS and PD-1 were also increased. Furthermore, intrahepatic expression of CBL-B positively correlated with serum levels of aspartate- or alanine-aminotransferase (AST or ALT), indicating that intrahepatic expression of CBL-B increases with liver injury and hepatic disease activity in patients with AIH. In contrast, CTLA-4, PD-1 and ICOS expression in peripheral blood T cells of treatment-naive AIH patients was similar to that in control groups. With RNA in-situ hybridisation we confirmed the findings of the gene expression analyses. Moreover, we identified that liver-infiltrating T cells and not CD3- cells in hepatic portal areas of treatment-naive AIH patients, showed increased expression levels of CBL-B, CTLA-4, ICOS and PD-1 as compared to those of DILI patients and AIH patients under treatment. Furthermore, expression of CBL-B or CTLA-4 in liver-infiltrating T cells of treatment-naive AIH patients positively correlated with disease activity expressed as mHAI. Flow cytometric analyses revealed that in contrast to intrahepatic T cells of healthy controls, NASH or DILI patients, the normally occurring reduction of CBL-B protein expression after anti-CD3/CD28 stimulation was not reduced in intrahepatic T cells of treatment-naive AIH patients. Moreover, intrahepatic T cells from treatment-naive AIH patients responded to stimulation with an increase in numbers of CTLA-4+CD4+ T cells, CTLA-4+CD8+ and PD-1+CD8+ T cells, as compared to healthy controls, DILI or NASH patients. Intrahepatic ICOS+CD4+ T cells of treatment-naive AIH patients were increased compared to those from healthy controls but not considerably different compared to DILI or NASH patients. We also showed that expression of CTLA-4 and PD-1 by CBL-Bhi T cells of treatment-naive AIH patients significantly differed as compared to control groups. To conclude, we identified aberrant expression of co-inhibitory T cell activation regulators CBL-B, CTLA-4 and PD-1 in intrahepatic but not in peripheral blood T effector cells in active AIH. Whether this is a counter-regulation against the increased activation of the intrahepatic T cells and to what extent this altered expression affects the intracellular cytokine production of the intrahepatic T cells, has to be further investigated. However, these molecules are potential biomarkers of disease activity and worthwhile objects of further study.

Die Autoimmune Hepatitis (AIH) ist eine chronisch entzündliche Lebererkrankung mit unbekannter Ätiologie und Pathogenese. Hochaktivierte T-Effektorzellen scheinen eine zentrale Rolle in der Immunpathogenese der AIH zu spielen, indem sie die Entzündung in der Leber vorantreiben. Unsere Hypothese ist, dass eine veränderte T-Zell Co-Stimulation oder Co-Inhibition für die überproportionale T-Zell-Aktivierung bei AIH verantwortlich ist und dies zu einer gestörten T-Zell-Immunantwort in AIH führt. Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene intrinsische regulatorische Moleküle der T-Zell-Aktivierung im peripheren Blut und in der Leber von atienten mit AIH zu analysieren. Zu diesem Zweck untersuchten wir CBL-B, CTLA-4, GRAIL, ICOS, ITCH, NEDD4, OX40, PD-1, PKCθ und TRAF6 in Leber und Blut von noch unbehandelten AIH-Patienten (n= 42) und AIH-Patienten unter immunsuppressiver Behandlung (n= 37) im Vergleich zu gesunden Kontrollen (n= 44), Patienten mit anderen autoimmunvermittelten Lebererkrankungen, wie PBC (n= 13) oder PSC (n=18) und Patienten mit nicht-autoimmunen Lebererkrankungen, wie DILI (n= 35) oder NASH (n= 17). Mithilfe des quantitativen Echtzeit-PCR-Screenings konnten wir feststellen, dass die Expression von CTLA-4, PD-1 und ICOS in Lebergewebeproben von unbehandelten AIH-Patienten im Vergleich zu Kontrollgruppen signifikant erhöht war. Darüber hinaus korrelierte die intrahepatische Expression von CBL-B, PD-1 und CTLA-4 bei AIH-Patienten positiv mit dem modifizierten Leberaktivitätsindex (mHAI) dieser Patienten, was darauf hindeutet, dass mit einer Zunahme der intrahepatischen Krankheitsaktivität auch die Expressionsniveaus von CBL-B, CTLA-4, ICOS und PD-1 anstiegen. Des Weiteren korrelierte die intrahepatische Expression von CBL-B positiv mit den Serumwerten der Aspartat- oder Alanin-aminotransferase (AST oder ALT), was darauf hinweist, dass die intrahepatische Expression von CBL-B mit der Leberschädigung bei AIH Patienten zunimmt. Im Gegensatz dazu war die Expression von CTLA-4, PD-1 und ICOS in peripheren Blut-T-Zellen von unbehandelten AIH-Patienten, derjenigen der Kontrollgruppen ähnlich. Mit der RNA-in-situ-Hybridisierung haben wir die Ergebnisse der Genexpressionsanalysen bestätigt. Zusätzlich haben wir festgestellt, dass die Leber-infiltrierenden T-Zellen und nicht die CD3- Zellen, in hepatischen Portalfeldern von unbehandelten AIH-Patienten eine erhöhte Expression von CBL-B, CTLA-4, ICOS und PD-1 im Vergleich zu DILI-Patienten und AIH-Patienten in Behandlung zeigten. Darüber hinaus korrelierte die Expression von CBL-B oder CTLA-4 in Leber-infiltrierenden T-Zellen von unbehandelten AIH-Patienten positiv mit der histologischen Krankheitsaktivität (mHAI). Durchflusszytometrische Analysen ergaben, dass die CBL-B-Proteinexpression bei intrahepatischen T-Zellen von unbehandelten AIH-Patienten nach anti-CD3/CD28-Stimulation nicht reduziert wurde, im Gegensatz zu gesunden Kontrollen, NASH- oder DILI-Patienten, bei denen die Stimulation eine deutliche Reduktion der CBL-B-Proteinexpression bewirkte. Des Weiteren reagierten intrahepatische T-Zellen von unbehandelten AIH-Patienten auf die Stimulation mit einer Zunahme von CTLA-4+CD4+ T-Zellen, CTLA-4+CD8+ und PD-1+CD8+ T-Zellen im Vergleich zu gesunden Kontrollen, DILI- oder NASH-Patienten. Intrahepatische ICOS+CD4+ T-Zellen von unbehandelten AIH-Patienten waren im Vergleich zu denen aus gesunden Kontrollen erhöht, unterschieden sich jedoch nicht wesentlich von denjenigen bei DILI- oder NASH-Patienten. Wir zeigten auch, dass sich die Expression von CTLA-4 und PD-1 durch CBL-Bhi T-Zellen von unbehandelten AIH-Patienten im Vergleich zu Kontrollgruppen signifikant unterscheidet. Zusammenfassend konnte eine abweichende Expression der intrinsischen T-Zell-Aktivierungsregulatoren CBL-B, CTLA-4 und PD-1 in intrahepatischen, jedoch nicht in peripheren Blut-T-Effektorzellen in aktiven AIH festgestellt werden. Ob dies eine Gegenregulation zur erhöhten Aktivierung der intrahepatischen T-Zellen war und inwieweit diese veränderte Expression die intrazelluläre Zytokinproduktion der intrahepatischen T-Zellen beeinflusste, muss weiter untersucht werden. Diese Moleküle eignen sich jedoch als potentielle Biomarker der Krankheitsaktivität und sollten Objekt weiterführender Studien sein.