Visualisierung des Typ III Translokator-Komplexes von Yersinia enterocolitica während der Wirtszellinfektion

Abstract

Viele Gram-negative Pathogene haben eine beeindruckende Strategie entwickelt, den infizierten Wirt zu manipulieren und der Immunantwort zu entkommen, um sich in ihren spezieseigenen Nischen zu vermehren und die Erkrankung zu etablieren. Maßgeblich daran beteiligt ist die heute als Typ III Sekretionssystem (T3SS) oder Injektisom bekannte Virulenzdeterminate, deren grundsätzlicher Aufbau stark konserviert ist. Die T3SS-exprimierenden Organismen verfügen über ein Arsenal artspezifischer, toxischer Effektor-Proteine, die durch T3-abhängige Translokation direkt in die Zielzellen injiziert werden und dort ihre zelldestruktive Funktion entfalten. Während Aufbau und Funktionsweise des Injektisoms und der Effektoren recht gut verstanden sind, gibt es wenig hochaufgelöste Informationen zur Struktur der Translokationspore und ihrer Regulation. Die beiden hydrophoben Translokator-Proteine YopB und YopD, sowie das hydrophile Nadelspitzen-Protein LcrV sind essentiell für die Translokation von Effektor-Proteinen und bauen den Poren-Komplex in der Wirtszellmembran auf. Dabei nimmt LcrV vermutlich eine unterstützende Rolle als Assemblierungsplattform ein, während YopB und YopD in die Membran inserieren und die Effektor-Injektion ermöglichen. Ziel der Arbeit war es den Translokator-Komplex von Yersinia enterocolitica während der Wirtszell-Infektion zu visualisieren und einerseits phenotypische Unterschiede zwischen Infektions- und Sekretionsbedingungen aufzuzeigen und andererseits die Frage zu klären, welchen räumlichen Bezug die Translokationspore zum Injektisom einnimmt. In der Literatur wird ein ununterbrochenes Injektions- oder Ein-Schritt-Modell gegenüber einer zweistufigen Reaktion mit intermediärer Komplexbildung im extrazellulären Raum diskutiert. Zusammenfassend erfolgte erstmals im Rahmen dieser Arbeit die hochaufgelöste immunfluoreszenzmikroskopische Darstellung des Translokator-Komplexes während der Yersinia-Infektion von Epithelzellen mittels STED-Mikroskopie, wobei eine signifikante Kolokalisation von YopB und YopD, sowie von YopB und LcrV beobachtet wurde. Dabei konnten während der WA 314-Wildtyp-Infektion von HeLa-Zellen unter Kontrollbedingungen 18,1 ± 7,6 YopB-Fluoreszenzkerne pro Bakterium identifiziert werden, was einem konfokal-zu-STED-Verhältnis von 1:3 entspricht. Verglichen mit publizierten cryo-elektronenmikroskopischen Daten von Injektisomen lässt sich schlussfolgern, dass hier die verbesserte Auflösung die Differenzierung einzelner Porenkomplexe erlaubte. Interessanterweise präsentierte nur ein geringer Anteil von 2 % des zellassoziierten Wildtyp-Stamms YopB oder YopD auf der Bakterienoberfläche, wohingegen bei 92 % respektive 86,5 % aller Bakterien unter Sekretionsbedingungen diese Translokator-Proteine auf der Oberfläche nachweisbar waren. Dabei wurde im Gegensatz zur Zellinfektion eine homogene Verteilung von YopB und YopD mittels STED bestätigt, was auf eine unspezifische Akkumulation auf der gesamten äußeren Bakterienmembran während der Sekretion in vitro hindeutete. Faktoren, die die Zahl Translokator-immungefärbter, zellgebundener Bakterien negativ beeinflussen, konnten die bakteriellen Proteine YopE, sowie YopB und YopD selbst und die eukaryote Rho GTPase Rac1 identifiziert werden. Mit Hilfe der GFP-fusionierten Injektisom-Komponente YscD, die in der inneren Bakterienmembran als Teil des Basalkörpers assembliert, konnte mittels hochauflösender SIM-Technik der Abstand von YopB zur Injektisomenbasis bestimmt werden. Dabei wurde eine Distanz von rund 100 nm ermittelt, was in etwa der Gesamtlänge des vollständig assemblierten T3S-Apparates einschließlich Translokon entspricht. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass während der Wirtszellinfektion die YopB/D-Translokationspore mit dem Injektisom verbunden bleibt und bei Y. enterocolitica unter den gewählten experimentellen Bedingungen das einstufige Injektionsmodell vorlag, was die kontinuierliche Verbindung von bakteriellem und Wirtszell-Zytoplasma annimmt und die direkte Injektion der Effektoren erlaubt.

Many Gram-negative bacteria have developed a sophisticated strategy to manipulate the infected host and evade the host immune response in order to propagate in their species specific niches and establish infection. This requires the key virulence determinant which is now known as the type III secretion system (T3SS) or injectisome. While the basic architecture of the T3SS is strongly conserved, each pathogen expresses a unique set of toxic effector proteins which are directly injected into the target cell cytoplasm - via a type III dependent manner - where they act on their specific targets. As assembly and function of the injectisome and effectors is quite well understood, the translocation pore lacks high resolution structural information and regulatory insight. The two hydrophobic translocators YopB and YopD together with the hydrophilic needle tip protein LcrV are essential for translocation of the effectors and hence believed to build up a pore complex in the host cell membrane. LcrV plays a supporting role as it acts as an assembly platform at the distal end of the needle for YopB and YopD which are believed to self-insert into the plasmamembrane and allow effector delivery. The Aim of this study was to visualize the Yersinia enterocolitica translocator complex during host cell infection and thereby pointing out potential differences to secretion permissive conditions, as well as to answer the question, if there is a spatial connection of the translocation pore to the injectisome. Currently there are two competing models discussed: the continuous injection- or one-step-model vs. the two-step reaction with the formation of an intermediate complex in the extracellular space. To summarize, we here show the first high resolution immunofluorescence images of the translocon during Yersinia-infection of epithelial cells using STED microscopy while observing a significant colocalization of YopB and YopD and YopB and LcrV, respectively. We identified 18.1 ± 7.6 YopB-spots per bacterial cell during WA-314 wildtype infection of control-treated HeLa-cells which corresponds to a confocal-STED-ratio of 1:3. Compared to published cryo-electrontomography data of Yersinia injectisomes our findings suggest that the improved resolution of STED allowed the differentiation of single pore complexes. Interestingly, only a small proportion of 2 % of cell-associated wildtype bacteria showed YopB or YopD-immunostaining on the bacterial surface during infection, although 92 % and 86.5 %, respectively, of all bacteria grown under secretion permissive conditions were homogeneously coated with these translocators. This was in contrast to the spot-like or clustered fluorescence signals during infection and indicates the unspecific accumulation of YopB and YopD on the outer bacterial membrane during secretion. Factors that negatively regulated the number of translocator-immunostained cellbound bacteria where identified as the bacterial proteins YopE, as well as YopB and YopD themselves and the eukaryotic Rho GTPase Rac1. With the use of the GFP-labeled injectisome component YscD, which assembles as part of the basal body in the inner membrane of the bacteria, we could determine the distance of YopB to the base of the injectisome using SIM. Measured distances gathered at around 100 nm which corresponds to the total length of the fully assembled injectisome including translocon. To conclude, our data indicate that the YopB/D translocation pore stays connected to the injectisome during host cell infection and that the one-step injection-model is favored in Y. enterocolitica which assumes a continuous channel between bacterial and host cell cytoplasm and allows direct effector injection, at least under the used laboratory conditions.