Zusammenfassung

Michael Dubber Dissertation, Universität Hamburg 2001

Thema dieser Dissertation war die Synthese Kohlenhydrat-zentrierter Dendrimere und Glycocluster. Mit den Glucose- und Trehalose-zentrierten PAMAM-Dendrimeren 2.06 und 2.20, konnten erstmals Dendrimere mit einem Kohlenhydrat-Kern hergestellt werden, welche eine besonders hohe Kernmultiplizität besitzen und daher andere Eigenschaften in biologischen Applikationen, wie Transfektions-Experimenten, besitzen sollten als die bisher bekannten Dendrimere. Um die dendritischen Äste möglichst nahe am Zucker zu plazieren und alle Hydroxylgruppen der Zucker auszunutzen, wurden verschiedene Methoden zur Synthese vollständig amino-funktionalisierter Kohlenhydratderivate evaluiert, wobei sich eine Sequenz aus Perallylierung, Hydroborierung, Appel-Reaktion und Gabrielsynthese als optimal erwies. Im Falle der Glucose-zentrierten Verbindung konnte über eine Perallylierung und Ozonisierung mit anschließender reduktiver Aminierung eine noch dichtere Gruppierung der Aminogruppen um den Kohlenhydrat-Kern erreicht werden.

Glycocluster sind multivalente Glycomimetika, die potentiell Kohlenhydrat-Lektin-Interaktionen inhibieren können und damit u. a. dazu geeignet sein können, die bakterielle Kolonisation humaner Gewebe zu verhindern. Die angestrebten hohen Inhibitionswerte werden erreicht, wenn der Glycocluster gleichzeitig Bindungen zu mehreren Kohlenhydrat-erkennenden Domänen eingehen kann, die ihrerseits meistens geclustert vorkommen, weil die Natur eben dieses Prinzip, der gleichzeitigen Ausbildung vieler schwacher Kohlenhydrat-Protein Bindungen zur Erlangung einer starken Bindung (Clustereffekt), in Zell-Zell-Kommunikationsprozeßen nutzt. Über die O-Glycosylierung von über Perallylierungs-Hydroborierungs-Sequenzen hergestellten Octopus-Glycosiden mit Hydroxypropyl-Armen konnten Glucose-, Trehalose-, Melibiose- und Raffinose-zentrierte, Mannose-ummantelte Glycocluster synthetisiert werden. Für jeden einzelnen der Kohlenhydrat-zentrierten Glycocluster mußten optimale Glycosylierungsbedingungen gefunden werden. Während die Glucose-zentrierten Octopus-Glycoside mit benzoylierten Imidaten in Dichlormethan bei einer sehr hohen Imidatkonzentration erschöpfend glycosyliert werden konnten (3.04 und 3.12), mußten die Oligosaccharid-zentrierten Glycocluster 3.15, 3.18 und 3.26 in Acetonitril bei einer sehr niedrigen Imidatkonzentration und leicht erhöhter Temperatur glycosyliert werden. Die Verwendung von Mannose als Ligand und der Aufbau aus bio-kompatiblen Fragmenten ermöglichte einerseits den sofortigen Einsatz in Assays zur Inhibition der Adhäsion von E.coli an Mannan und soll anderseits den Einsatz gegen die Kolonisation humaner Gewebe mit uropathogenen E. coli ermöglichen.

Ein Grundmotiv der Chemie dieser Dissertation war die erschöpfende Umsetzung sterisch gehinderter polyfunktioneller Moleküle, wobei die Umsetzung der letzten Funktionalität jeweils die schwierigste war. An den Bruker Biflex III MALDI-TOF-Massenspektrometern, die zur Verfügung standen, konnten Protokolle entwickelt werden, mit denen sowohl die Anzahl der umgesetzten Funktionalitäten, als auch das Ausmaß an unerwünschten Nebenreaktionen, wie der Orthoesterbildung, ermittelt werden konnte.

Für eine Vielzahl von Immunbindungsassays werden funktionalisierbare Glycocluster benötigt, welche mit Biotin oder Fluoreszenzmarkern verknüpft werden können. Zu diesem Zwecke wurde ein Mannose-ummantelter Glucose-zentrierter Glycocluster mit einer freien Amino-Funktionalität synthetisiert, mit dem zahlreiche biologisch aktive Gruppen gekuppelt werden können. Neben dem biotinylierten Glycocluster 4.16 und verschiedenen fluoreszierenden Glycoclustern (4.18, 4.20 und 4.21) wurden Glycolipidmimetika synthetisiert, die neben Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen zusätzliche hydrophobe Wechselwirkungen zu Kohlenhydrat-bindenden Proteinen (Lektinen) ausbilden können (4.23, 4.24, 4.26 und 4.28).

Nachdem zahlreiche Dendrimere und Glycocluster mit Hilfe schwer steuerbarer Reaktionen, welche zudem mit komplexen Nebenreaktionen konkurrieren, wie O-Glycosylierungen und reduktiver Aminierung, synthetisiert worden waren, wurden auch noch einfacher kontrollierbare Reaktionen wie Peptid-, Thioharnstoff- und Oxim-Kupplungen für den Aufbau Kohlenhydrat-zentrierter Glycocluster evaluiert. Die dabei synthetisierten Glucose-zentrierten Glycocluster 5.11, 5.22 und 5.35 genügen zwar wahrscheinlich nicht allen toxikologischen Anforderungen, sind dafür aber einfach strukturell variierbar.

Um die Fülle der hier erarbeiteten Ergebnisse besser überblicken zu können, ist eine besonders übersichtliche Gliederung gewählt worden, die es erlaubt in einzelnen Kapitel unabhängig von der Lektüre anderer "einzusteigen". So mag ein zeitlich übersichtlich gehaltener Einblick in die Arbeitsgebiete dieser Dissertation auch jenseits des kurzen Abrisses in dieser Zusammenfassung gelingen.

Summary

Doctoral Thesis of Michael Dubber, University of Hamburg, 2001

Subject of this thesis was the synthesis of carbohydrate-centered dendrimers and glycoclusters. With the synthesis of the glucose and trehalose-centered PAMAM dendrimers 2.06 and 2.20, dendrimers with a carbohydrate core were synthesised for the first time. These dendrimers are characterised by unusually high core multiplicities and should therefore have different properties in biological applications, e.g. transfection experiments, than dendrimers known to date. Several methodologies were evaluated to exploit each and every hydroxyl group, and to arrange the dendritic branches as tightly as possible around the carbohydrates. A sequence of perallylation, hydroboration, Appel reaction and Gabriel synthesis has proved to be optimal. In the case of the glucose-centered dendrimer, an even tighter arrangement of amino groups was achieved by a sequence of perallylation, ozonisation and subsequent reductive amination.

Glycoclusters are multivalent glycomimetics, which may be able to inhibit carbohydrate-lectin interactions and may therefore be used for prevention of bacterial colonisation of human epithelial tissues. The desired high inhibition values can be achieved, if the glycocluster binds to several carbohydrate recognition domains simultaneously. In Nature, these carbohydrate recognition domains are usually clustered, because Nature herself exploits this very phenomenon in cell-cell communication processes – the simultaneous formation of several weak carbohydrate-protein bonds results in one strong interaction (cluster glycoside effect). Glucose-, trehalose-, melibiose- and raffinose-centered glycoclusters coated with mannose were synthesised by O-glycosylation of octopus glycosides with hydroxypropyl branches, which were synthesised by a perallylation and hydroboration sequence. It was necessary to optimise the glycosylation conditions individually for each carbohydrate-centered glycocluster. For example, the glucose-centered octopus glycosides were perglycosylated by treatment with a solution of dichloromethane with very high imidate concentration (3.04 and 3.12), whereas the oligosaccharide-centered octopus glycosides 3.15, 3.18 and 3.26 were perglycosylated by treatment with solutions of very low imidate concentration, but with slightly elevated temperatures. The application of mannose as ligand and because only biocompatible fragments were used for the construction of these glycoclusters, it was possible to employ them immediately in assays to determine their efficacy in inhibition of Type 1 fimbriae-mediated adhesion of E. coli to mannan. In addition, these properties should enable the usage of these glycoclusters in prevention of the colonisation of human tissues by uropathogenic E. coli.

One of the main targets of the chemistry presented here was the complete reaction of sterically hindered polyfunctional molecules, whereby the reaction of the last functionality always proved to be the most difficult. The available Bruker Biflex III MALDI-TOF mass spectrometers made it possible to determine the number of functionalites reacted and the extent of undesired side-reactions such as orthoester formation.

Functionalised glycoclusters which can be labelled with biotin or with a fluorescence marker are needed for a number of immunoassays. To this end, a mannose-coated, glucose-centered glycocluster with a free amino group was synthesised, which can be coupled to a range of biologically active groups. In addition to the biotinylated glycocluster 4.16 and several fluorescent glycoclusters (4.18, 4.20 and 4.21), glycolipid mimetics were synthesised (4.23, 4.24, 4.26 and 4.28), which take advantage of both carbohydrate-protein interactions and additional hydrophobic interactions with carbohydrate binding proteins (lectins).

After numerous dendrimers and glycoclusters had been synthesised using reactions which are difficult to control and which have complex side-reactions (such as O-glycosylation and reductive amination), several easily controllable reactions such as peptide, thiourea and oxim couplings were employed for the synthesis of carbohydrate-centered glycoclusters. The glucose-centered glycoclusters 5.11, 5.22 and 5.35 were synthesised in this manner. These glycoclusters can easily be tailored, but probably will not fulfill all toxicological requirements.

A user-friendly structure for this thesis has been chosen, which should allow the reader to read the chapter most relevant for him or her independent of the others. Thus it should be possible to win an insight into the various subjects of this thesis in short amount of time.