Die 5' frankierenden Regionen der Exons eins und zwei wurden in Transfektionsstudien auf ihre Promoteraktivität hin untersucht. Durch PCR wurden serielle Deletionen der Regionen hergestellt und die Promoteraktivität der verschiedenen Bereiche mit Hilfe des heterologen Reportergens Luziferase bestimmt.
Der 5' frankierende Bereich von Exon 1 (proximaler Promoter) wurde in sieben seriellen Deletionen amplifiziert, deren 5'-Ende immer näher an die Transkriptionsstartstelle rückte. Das 3'-Ende schloß in allen PCR-Produkten die Transkriptionsstartstelle ein, deren Position durch Primer Extensionsanalyse und 5' RACE bestimmt worden war (18). Die PCR-Produkte wurden in den pGL3-Basic Vektor kloniert, in dem sie die Expression des Luziferase-Reportergens steuerten. Die Vektorkonstrukte aus dem 5' flankierenden Bereich von Exon 1 erhielten die Namen LP1 bis LP7. Ausgehend von der Transkriptionsstartstelle ATG endeten LPI und LP2 an Position +92, LP3 bis LP7 an Position +24. Damit ergaben sich die folgenden seriellen Deletionsbereiche.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Promoterfragmentlängen des proximalen Promoterbereiches LP. Die Promoterfragmente LP1 und LP2 konnten durch natürlich vorhandene Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen innerhalb des Promoterbereiches isoliert werden. Die Fragmente LP3-LP7 wurden mit Hilfe von Mismatch-Oligonukleotiden als PCR-generierte Fragmente zunächst amplifiziert und nach Aufreinigung über Agarosegel-Elektrophorese in pGEM-T kloniert. Aus diesem Plasmid wurden sie durch Hydrolyse mit Restriktionsendonukleasen isoliert.
Exakte Position der amplifizierten Promoterbereiche (5' UTR von Exon 1):
LP1 (-2535 bis +92)
LP2 (-2089 bis +92)
LP3 (-924 bis +28)
LP4 (-495 bis +28)
LP5 (-140 bis +28)
LP6 (-63 bis +28)
LP7 (-20 bis +28)
Abbildung 4: LPI/2-Konstrukt als Beispiel der konstruierten Promoter-Reportergen-Plasmide. Die Promoterfragmente der 5' frankierenden Bereiche von Exon 1 und 2 wurden wie oben beschrieben isoliert und in die MCS des mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen hydrolysierten pGL3-Basic-Vektors kioniert. Aus dieser Position steuern sie die Expression des 3' gelegenen Luziferase-Reportergens. Die erfolgreiche Klonierung und korrekte Orientierung der Promoterfragmente wurde durch Restriktionsanalyse mit geeigneten Restriktionsendonukleasen nachgewiesen.
Die 5' flankierende Region von Exon 2 (distaler Promoter) wurde ebenfalls in sieben seriellen Deletionen amplifiziert und in den pGL3-Basic Vektor kloniert. Die Konstrukte wurden als IP 1 bis IP7 bezeichnet. Wie bei den LP-Konstrukten nähern sich die 5'-Enden der PCR-Produkte der Transkriptionsstartstelle, die in allen Konstrukten enthalten ist. Die 3'-Enden liegen an Position +81 (IP1) bzw. +63 (IP2 bis IP7) von der Transkriptionsstartstelle ATG. Das MED-1 Motif des intestinalen Promoters, das zwischen +49 und +53 lokalisiert ist, war damit ebenfalls vollständig in allen Konstrukten erhalten.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Promoterfragmentlängen der seriellen Deletionen des distalen Promoterbereiches IP. Das Promoterfragment IP1 konnte durch natürlich vorhandene Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen innerhalb des Promoterbereiches isoliert werden. Die Fragmente IP2-IP7 wurden mit Hilfe von Mismatch-Oligonukleotiden als PCR-generierte Fragmente zunächst ainplifiziert und nach Aufreinigung über Agarosegel-Elektrophorese in pGEM-T kloniert. Aus diesem Plasmid wurden sie durch Hydrolyse mit Restriktionsendonukleasen isoliert.
Exakte Position der amplifizierten Promoterbereiche (5' UTR von Exon 2):
IP 1 (-2070 bis +8 1)
IP2 (-1167 bis +63)
IP3 (-581 bis +63)
IP4 (-318 bis +63)
IP5 (-216 bis +63)
IP6 (-161 bis +63)
IP7 (-52 bis +63)
Um gewebsspezifische Unterschiede in der Aktivität der Konstrukte zu erfassen, wurden Transfektionen in drei unterschiedliche Zellinien durchgeführt. HuH7, eine humane Hepatomzellinie, hat zelluläre Eigenschaften, die denen der humanen Leber in vivo nahekommen. Diese Zellinie wurde gewählt, um die Aktivität des hepatischen Promoters in einer der Leber möglichst nahe kommenden zellulären Umgebung messen zu können. CaCo2, eine humane Kolonkarzinomzellinie, bietet die Bedingungen humaner intestinal er Zellen. Eine geeignete Dünndarmzellinie, die die optimale Einschätzung des intestinalen Promoters gewährleisten würde, existiert zur Zeit der Untersuchung nicht. NIH3T3 ist eine murine Fibroblastenzellinie, die stellvertretend für jene Gewebe gewählt wurde, in denen Apo B mRNA Editing normalerweise keine große physiologische Relevanz hat.
Die Promoterstärke des längsten LeberPromoterfragmentes, LPI, war in HuH7-Zellen 2,5fach stärker als in CaCo2-Zellen. In NIH3T3-Zellen war die Aktivität von LP1 3-fach stärker als in CaCo2-Zellen. Die Konstrukte LP2 und LP3 zeigten eine allmähliche Abschwächung der Promoteraktivität in allen drei Zellinien. Verglichen mit LP1 betrug der Aktivitätsverlust von LP3 in HuH7-Zellen etwa 30 %, in CaC2-Zellen etwa 60 % und in NIH3T3-Zellen etwa 85 %. Bei den Konstrukten LP4 und LP5 stieg die Aktivität dagegen in allen drei Zellinien wieder an. Gegenüber LP3 betrug der Aktivitätszuwachs von LP5 in HuH7-Zellen etwa 85 %, in CaCo2-Zellen etwa 280 % und in NIH3T3-Zellen etwa 650 %. LP5 zeigte damit eine Promoterstärke, die über die von LP1 hinausging. Dieses Konstrukt enthielt das TAAA Motif (Position -16 bis -13, als mögliche Variante einer TATA-Box) und das CACT Motif (Position -101 bis -98, eine mögliche Variante der CAT-Box). In LP6 war das CACT-Motif nicht mehr vorhanden. Dieses Konstrukt wies eine stark reduzierte Aktivität auf. LP7 enthielt praktisch nur noch die mögliche TATA-Box und hatte alle Promoteraktivität verloren, etwa vergleichbar mit pGL3-Basic, der Promoterlosen Kontrolle. Das Konstrukt -LP1, das das Promoterfragment von LP1 in umgekehrter Orientierung enthielt, wies eine geringere Aktivität auf als das Promoterlose Konstrukt pGL3-Basic. Die Ergebnisse der Transfektionsstudien der Konstrukte LP1-LP7 sind in Abb. 6 zusammengefaßt dargestellt.
Abbildung 6: Relative Luziferase-Aktivität der Konstrukte LP1 bis LP7 in HuH7-, CaCo2- und NIH3T3-Zellen. Je 2 µg Konstrukt-DNS und 0,3 µg β-Galaktosidase-Referenzvektor (CMV-β-Gal) wurden in dreifachem Ansatz in 2x105 HuH7-, CaCo2- und NIH3T3-Zellen transfiziert. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Aktivitäten von Luziferase und β-Galactosidase mit dem Luciferase Assay System (Promega) bzw. dem Galacto-Light-Plus Chemoluminescent Reporter Assay (Tropix) bestimmt. Durch schwankende Transfektionseffizienz bedingte Unterschiede der Luziferase-Aktivität wurden durch Quotientenbildung der Werte von Luziferase- und β-Galactosidase ausgeglichen. Die relative Luziferase-Aktivität ist als Vielfaches des pGL3 Basic Vektors in der jeweiligen Zellinie angegeben. Aus mindestens drei Transfektionen wurden Mittelwerte und SEM berechnet.
IP1, das längste Fragment des intestinalen Promoterbereiches, zeigte in CaCo2-Zellen eine viermal so starke Aktivität wie in HuH7-Zellen. Dieses Verhältnis fand sich bei den Konstrukten IP2, IP3 und IP4 in etwa wieder. Auch die absolute Höhe der Luziferaseaktivität war bei allen vier Konstrukten in etwa vergleichbar. Die relative Luziferaseaktivität der Konstrukte IP5 und IP6 zeigte dagegen einen deutlichen Anstieg. Im Vergleich zu IP1 war die Aktivität von IP6 in CaCo2-Zellen verdoppelt. In HuH7-Zellen betrug die Aktivitätszunahme von IP6 im Vergleich zu IP1 sogar das fünffache. Die Stärke des Konstruktes IP7 fiel demgegenüber stark ab. Verglichen mit IP6 war sie in CaCo2-Zellen auf ein Viertel, in HuH7-Zellen auf ein Sechstel reduziert. Allerdings war die Aktivität in CaCo2-Zellen noch vergleichsweise hoch. In NIH3T3-Zellen zeigten die intestinalen Promoterkonstrukte nur eine minimale Wirkung. Die Promoteraktivität ähnelte bei sämtlichen Konstrukten der des promoterlosen Kontrollkonstruktes pGL3-Basic. Auch IP5 und IP6 zeigten keinen nennenswerten Aktivitätszuwachs gegenüber IP1 oder anderen Konstrukten. Das -IP2-Konstrukt, in dem sich das IP2-Fragment in umgekehrter Orientierung befand, hatte, ähnlich wie -LP1, eine geringere Promoterstärke als das pGL3 Basic-Konstrukt ohne Promoter. Die Ergebnisse der Transfektionsstudien der Konstrukte IP1 -IP7 sind in Abb. 7 zusammengefaßt dargestellt.
Abbildung 7: Relative Luziferase-Aktivität der Konstrukte IP1 bis IP7 in HuH7-, CaCo2- und NIH3T3-Zellen. Je 2 µg Konstrukt-DNS und 0,3 µg β-Galaktosidase-Referenzvektor (CMV-β-Gal) wurden in dreifachem Ansatz in 2x105 HuH7-, CaCo2- und NIH3T3-Zellen transfiziert. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Aktivitäten von Luziferase und β-Galactosidase mit dem Luciferase Assay System (Promega) bzw. dem Galacto-Light-Plus Chemoluminescent Reporter Assay (Tropix) bestimmt. Durch schwankende Transfektionseffizienz bedingte Unterschiede der Luziferase-Aktivität wurden durch Quotientenbildung der Werte von Luziferase- und β-Galactosidase ausgeglichen. Die relative LuziferaseAktivität ist als Vielfaches des pGL3 Basic Vektors in der jeweiligen Zellinie angegeben. Aus mindestens drei Transfektionen wurden Mittelwerte und SEM berechnet.
In weiterarbeitenden Versuchen wurden die Konstrukte LP1-LP7 und IP1-IP7 in HuH7-Zellen transfiziert und geprüft, ob durch Zusatz verschiedener Hormone zum Wachstumsmedium die Promoteraktivität beeinflußt wird. Untersucht wurden die Hormone Insulin (10 nM), Triiodthyronin (50 nM), Östradiol (50 nM), Dexamethason (100 nM), Glucagon (5 nM) und Somatotropes Hormon (50 nM). Jedes Hormon wurde einzeln oder in Kombination mit anderen Honnonen in mindestens drei Versuchen mit je drei voneinander getrennten Ansätzen geprüft. In diesen Versuchen konnten keine statistisch relevanten Aktivitätsunterschiede gefunden werden, weder in der Aktivität der vollständigen Promoter noch in der Aktivität einzelner Deletionsfragmente.
Der starke Aktivitätszuwachs des Konstruktes IP5 im Vergleich zu den längeren Konstrukten, der in der Untersuchung des distalen Promoters demonstriert werden konnte, ließ die Existenz eines 5' von IP5 gelegenen, negativ regulierenden Elementes vermuten. Um es einzugrenzen, wurde dieser Bereich genauer untersucht. Die Konstrukte IPΔ1144-216 und IPΔ556-216 entstanden, indem die Promoterregionen -2070 bis -1145 bzw. -2070 bis -557 des intestinalen Promoters durch PCR amplifiziert und direkt vor den 5' Terminus des IP5-Konstruktes kloniert wurden. Die so entstandenen Konstrukte entsprechen IP1 ohne die Bereiche -1144 bis -216 bzw. -556 bis -216.
Abbildung 8: Schematische Darstellung der Promoterbereiche der Deletionskonstrukte IPA(1144-216) und IPA(556-216). Mit Hilfe des vektorspezifischen Oligonukleotids SP6 und der Oligonukleotide MS22 und MS23 wurden die Bereiche -2070 bis -557 und -2070 bis -1145 des intestinalen Promoters amplifiziert. Nach Isolierung der gewünschten PCR-Produkte über ein Agarosegel und Hydrolyse mit Sac I wurden die Promoterbereiche 5' des IP5-Promoterbereiches in das IP5-Konstrukt kloniert. Die so entstandenen Konstrukte entsprechen IP1 ohne die Bereiche -1144 bis -216 bzw. -556 bis -216.
Um zu prüfen, ob das postulierte negativ regulierende Element universal wirksam ist, wurden die Überkreuz-Mutanten IP(1167-266)LP5, IP(581-266)LP5 und IP(318-266)LP5 konstruiert. Die Regionen - 1167 bis -266, -581 bis -266 und -318 bis -266 des intestinalen Promoters wurden amplifiziert und direkt vor das 5' Ende des Leberpromoterkonstruktes LP5 ligiert.
Abbildung 9: Schematische Darstellung der der Promoterbereiche der Überkreuzkonstrukte IP(1167-266)LP5, IP(518-266)LPS und IP(318-266)LP5. Unter Verwendumg der Oligonukleotide MS 12-14 sowie MS 22 wurden die Promoterbereiche -1167 bis -266, -581 bis -266 und -318 bis -266 des intestinalen Promoters amplifiziert. Nach Hydrolyse mit Sac I und Nhe I und Agarosegelisolierung wurden sie direkt vor das 5' Ende des Promorbereiches des Konstruktes LP5 ligiert.
Zusammen mit den Konstrukten IP1, IP5 und LP5 wurden diese Konstrukte nun in HuH7-, CaCo2- und NIH3T3-Zellen transfiziert. Verglichen mir IP1 zeigte IPΔ1144-216 eine weitaus höhere relative Luziferaseaktivität. Sie entsprach in etwa der des Konstruktes IP5. Am deutlichsten zeigte sich der Aktivitätszuwachs von IPΔ1144-216 gegenüber IP5 in HuH7-Zellen, in denen die Deletionsmutante dreifach stärker war als das vollständige Fragment. Auch in CaCo2-Zellen kam es zu einem starken Aktivitätszuwachs um etwa 100 %, wodurch die Aktvität von IPΔ1144-216 in HuH7- und CaCo2-Zellen etwa gleich hoch war. In NIH3T3-Zellen konnte zwar ebenfalls eine Zunahme der relativen Luziferaseaktivität von IPΔ1144-216 gegenüber IP1 demonstriert werden, jedoch war der Effekt bei dem insgesamt niedrigen Aktivitätsniveau von IP in NIH3T3-Zellen zu vernachlässigen. IPΔ556-216 hatte in allen drei Zellinien eine weitaus geringere Promoterwirkung als IPΔ1144-216. Sowohl in HuH7- als auch in CaCo2-Zellen reduzierte sich die Aktivität dieses Konstruktes auf etwa ein Viertel der Aktivität von IPΔ1144-216 und entsprach annähernd der von IP1. Wie die anderen intestinalen Konstrukte zeigte auch IPΔ556-216 nur eine geringe relative Luziferaseaktivität in NIH3T3-Zellen. Trotzdem waren auch in dieser Zellinie IP5 und IPΔ1144-216 doppelt so stark wie IP1 und IPΔ556-216. Die Ergebnisse der Transfektionsstudien der Konstrukte IP1, IP5, IPΔ(1144-216) und IPΔ(556-216) sind in Abb. 10 zusammengefaßt dargestellt.
Abbildung 10: Relative Luziferase-Aktivität der Konstrukte IP1, IP5, IPΔ(1144-216) und IPΔ(556-216) in HuH7-, CaCo2- und NIH3T3-Zellen. Je 2 lag Konstrukt-DNS und 0,3 gg β-GalaktosidaseReferenzvektor (CMV-β-Gal) wurden in dreifachem Ansatz in 2x 105 HuH7-, CaCo2- und NIH3T3-Zellen transfiziert. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Aktivitäten von Luziferase und β-Galactosidase mit dem Luciferase Assay System (Promega) bzw. dem Galacto-Light-Plus Chemoluminescent Reporter Assay (Tropix) bestimmt. Durch schwankende Transfektionseffizienz bedingte Unterschiede der Luziferase-Aktivität wurden durch Quotientenbildung der Werte von Luziferase- und β-Galactosidase ausgeglichen. Die relative Luziferase-Aktivität ist als Vielfaches des pGL3 Basic Vektors in der jeweiligen Zellinie angegeben. Aus mindestens drei Transfektionen wurden Mittelwerte und SEM berechnet.
Die Überkreuzmutante IP(1167-266)LP5 hatte im Vergleich zu LP5 eine deutlich reduzierte Wirkung in allen drei Zellinien. In HuH7- und NIH3T3-Zellen konnte eine Akivitätsabnahme auf ein Drittel, in CaCo2-Zellen auf die Hälfte der Aktivität von LP5 demonstriert werden. IP(581-266)LP5 und IP(318-266)LP5 hatten demgegenüber eine konsekutiv zunehmende Aktivität in allen drei Linien. Allerdings hatte selbst IP(318-266)LP5 im Vergleich zu LP5 noch eine um etwa ein Drittel verminderte Promoterwirkung. Die Ergebnisse der Transfektionsstudien der Konstrukte IP(1167-266)LP5, IP(581-266)LP5 und IP(318-266)LP5 sind in Abb. 11 zusammengefaßt 9 dargestellt.
Abbildung 11: Relative Luziferase-Aktivität der Konstrukte IP(1167-266)LP5, IP(581-266)LP5 und IP(318-266)LP5 in HuH7-, CaCo2- und NIH 3T3 Zellen. Je 2 µg Konstrukt-DNS und 0,3 µg β-Galaktosidase-Referenzvektor (CMV-β-GAL) wurden in dreifachem Ansatz in 2x105 HuH 7-, CaCo2- und NIH 3T3-Zellen transfiziert. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Aktivitäten vun Luziferase und β-Galactosidase mit dem Luciferase Assay System (Promega) bzw. dem Galacto-Light-Plus Chemoluminescent Reporter Assay (Tropix) bestimmt. Durch schwankende Transfektionseffizienz bedingte Unterschiede der Luziferase-Aktivität wurden durch Quotientenbildung der Werte von Luziferase- und β-Galactosidase ausgeglichen. Die relative Luziferase-Aktivität ist als Vielfaches des pGL3 Basic Vektors in der jeweiligen Zellinie angegeben. Aus mindestens drei Transfektionen wurden Mittelwerte und SEM berechnet.
Abschließend wurde ein Minigen konstruiert, in dem das Apobec-1-Gen der Ratte unter Kontrolle des hepatischen Promoters exprimiert wurde. Das Konstrukt pApobec-1 basiert auf dem pT7T3-Plasmidvektor. Es enthält die 5' flankierende Region von Exon 1 (-2535 bis +28, LP) des Apobec-l-Gens der Ratte. Dieser Bereich steuert die hepatische Apobec-1-Expression. Ferner enthält das Plasmid die vollständige cDNA des Apobec-1-Genes der Ratte (-31 bis 699), sowie die SV40 small T antigen splice site und die SV40 early poly(A) site innerhalb des pT7T3 Plasmides.
Abbildung 12: schematische Darstellung des pT7T3 Apobec-1 Minigens (pApobec-1). Ein 2100 bp langes Fragment des proximalen Promoters wurde durch Hydrolyse mit Sal I aus dem pGEM-T-Vektor isoliert. Es wurde in das ebenfalls mit Sal I hydrolysierte und mit CIP behandelte Konstrukt pT7T3-Apobec1-SV40 ligiert. pT7T3-Apobec-1-SV40 enthält die vollständige Apobec-l-cDNA der Ratte, die SV 40 small T Antigen splice site und das SV 40 late poly (A) Signal. Die Expression von Apobec-1 wird durch das 5' davon gelegene Promoterfragment gesteuert.
pApobec-1 wurde in HuH7-Zellen transfiziert, wn zu untersuchen, ob der Promoterbereich LP imstande ist, Apobec-l-Expression in HuH7-Zellen zu induzieren und so in einer humanen Leberzellinie mRNA Editing zu rekonstituieren. Als Positivkontrolle wurden HuH7-Zellen mit pSVL-Apobec-1 transfiziert. In diesem Plasmid wird die Apobec-l-Expression durch den SV40 late Promoter gesteuert, einen viralen Promoter mit hoher Aktivität. Als Negativkontrolle diente eine "Mock"-Transfektion ohne DNA. In mit pApobec-1 transfizierten HuH7-Zellen konnte Apo B mRNA Editing durch Editing Assay nachgewiesen werden. In den ohne DNA transfizierten Zellen (Negativkontrolle) wurde Apo B mRNA nicht editiert. Auch in der Positivkontrolle, in der die Apobec-1-Expression durch den starken viralen SV4O-Promoter gesteuert wurde, konnte Apo B mRNA Editing demonstriert werden. Im Vergleich zur Positivkontrolle zeigten mit pApobec-1 transfizierte Zellen eine geringere Editing-Aktivität.
Abbildung 13: Apo B mRNA Editing Aktivität in mock-transfizierten sowie mit pSVL-Apobec-1 und p-Apobec-1 transfizierten HuH7-Zellen. HuH7-Zellen wurden mit unspezifischer DNA (mock), PSVLApobec-1 und pApobec-1 transfiziert. 48 h nach Transfektion wurde die Gesamt-RNS der Zellen präpariert und die Apo B mRNS durch RT-PCR amplifiziert. Nach Aufreinigung über Mikrospin-Säuten wurden die Apo B RT-PCR-Produkte durch Oligonukleotid-Extensionsassay auf Editing untersucht. Gezeigt ist ein 8 h Autoradiograrnm der Extensionsprodukte nicht-editierter (C) und editierter (U) Apo B mRNS.