DNS- oder RNS-Lösungen wurden mit 3 Vol Ethanol und 1/10 Vol Natriumacetat (pH 7,0) 3 M 15 min bei -80 °C ausgefällt. Das Präzipitat wurde 15 min bei 13000 Upm pelletiert (Biofuge 13, Heraeus), nach vollständiger Entfernung des Überstandes an der Luft getrocknet und in Wasser gelöst.
Um Proteine aus einer DNS-Lösung zu entfernen, wurde sie mit 1 Vol TE-gesättigtem Phenol versetzt und gut geschüttelt. Die Phasen wurden durch Zentrifagation (14000 Upm für 1 min) getrennt. Der DNS enthaltende wässrige Überstand wurde ohne die Interphase in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und der Vorgang wiederholt. Durch zweimalige Extraktion mit 1 Vol Chloroform/Isoamylalkohol (24/1 v/v) wurde Phenol aus der wässrigen Phase entfernt. Anschließend wurde die DNS gefällt.
Ein lag DNS wurde mit mindestens 2 u Restriktionsendonuklease (Pharmacia Biotech) im vom Hersteller empfohlenen Puffer für mindestens 1 h bei 37 °C hydrolysiert. Dabei betrug das Volumen der glyzerinhaltigen Enzymlösung nie mehr als 10 % des Gesamvolumens. Die DNS wurde ausschließend gefällt oder durch Größenauftrennung und Aufreinigung aus dem Agarosegel isoliert (s. 1.4.3).
Um die Religation linearisierter Plasmide während einer Ligationsreaktion zu verhindern, wurden die 5'-Phosphatgruppen mit Calf Intestine Phosphatase (CIP, Pharmacia Biotech) abgesparten. Die DNS wurde in 20 µl CIP Inkubationspuffer (Ix) mit 5 u CIP 30 min bei 37 °C inkubiert. Das Enzym wurde 30 min bei 68 °C hitzeinaktiviert und durch Phenolchloroformextraktion aus dem Reaktionsasnsatz entfernt.
CIP-Inkubationspuffer (10x) | Tris-HCI 500mM, EDTA 100 riM, pH8,5 |
Etwa 50 ng linearisierter Plasmidvektor wurden mit einem im Überschuß vorhandenen, mit kompatiblen Restriktionsendonukleasen hydrolysierten und aufgereinigten DNSFragment in 20 µl Ligationspuffer (Ix) mit 1 mM ATP und 2 u Ligase (Pharmacia Biotech) 8 h bei 16 °C ligiert. Als Kontrolle diente eine Reaktion ohne DNS-Fragment.
Ligationspuffer (1Ox) | Tris-HCI (pH 7,6) 200 mM, M9C12 1 00 MM, Dithioerythrit 100 mM |
Die Herstellung kompetenter Bakterien erfolgte nach Inoue et al. (Gene 96:23-28). Es wurden E. Coli des Stammes XL- 1 verwendet.
40 µl kompetente E. coli wurden mit maximal 1/10 Vol Ligationsansatz 20 min auf Eis inkubiert, 40 s lang auf 37 °C erwärmt und dann nochmals 5 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 450 ml LB-Medium und 30 min Inkubation bei 37 °C wurde die Probe auf LB+Amp-Platten ausgestrichen. Auf diesen Platten wachsen nur Bakterien, die Plasmid-DNS mit der Ampicillin-Resistenz aufgenommen haben.
LB-Medium | Trypton 1 0 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, NaC1 1 0 g/l, autoklavieren. |
LB+Amp-Platten | Trypton 10 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, NaC1 1 0 g/l, Bi-Tel-Agar 15 g/l, autoklavieren und 1 00 @g/1 Ampicillin hinzufügen. |
5 ml LB-Medium mit 100 ng/ml Ampicillin wurden mit transformierten Bakterien beimpft und 12 h bei 37 °C geschüttelt.
Sollten Bakterien einer Übemachtkultur aufbewahrt werden, wurden 700 µl mit 300 µ1 Einfriermedium für Bakterien versetzt und bei -80 °C tiefgefroren.
Einfriermedium für Bakterien | Glyzerin 50 %, Tris (pH 7,5) 1 0 mM. |
1,5 ml einer Übernachtkultur wurden eine Minute bei 5000 Upm abzentrifugiert und in 200 µl Puffer 1 resuspendiert. Zur Denaturierung der Bakterien wurde 200 µl Puffer 2 zugegeben, gemischt und 5 min inkubiert. Die Probe wurde mit 200 µl Puffer 3 neutralisiert, gemischt, 10 min inkubiert und anschließend 10 min bei 13000 Upm zentrifugiert. 500 µl des Überstandes wurden mit 1000 µl Ethanol absolut gefällt, 15 min auf Eis inkubiert, das Präzipitat pelletiert und mit 70% Ethanol gewaschen. Die PlasmidDNS wurde luftgetrocknet und in 50 µl Wasser gelöst. Die Messung der optischen Dichte erfolgte durch Extinktionsmessung in einem Genequant II-Gerät (Pharmacia Biotech).
Puffer 1 | Tris-HCI (pH 8,0) 50 mM, EDTA (pH 8,0) 10 mM, RNAse A 100 µg/ml | Puffer 2 | NAOH 200 mM, SDS 1 % | Puffer 3 | Kaliumacetat (pH 5,5) 3 M |
Die Isolierung größerer Mengen Plasmid-DNS erfolgte mit einem Quiagen Plasmid Maxi Kit (QIAgen) nach den Angaben des Herstellers.
S. 1.3.1
0,8-2 % (w/v) Agarose wurde in TBE-Puffer (Ix) in der Mikrowelle aufgekocht. Nach Abkühlung auf Handwärme wurden 5 µl Ethidiumbromid zupipettiert und die Lösung in einen Gelschlitten mit Kamm gegossen. Die DNS wurde auf den so hergestellten Gelen in 10 µl Ladepuffer (1x) bei 50-200 V (je nach Elektrodenabstand) in einer Sub Cell,GT Gelkammer (Biorad) der Größe nach aufgetrennt. Als Laufpuffer diente TBE-Puffer (1x), als Grössenmarker ein Lambda-DNS Hind III Hinc II Digest (Pharmacia).
TBE-Puffer (5x) | Tris-HCI 54 g/l, Borsäure 22,5 g/l, EDTA 3 g/l |
Ladepuffer für Agarosegele (10x) | Glyzerin 80 %, TBE (10x), Bromphenolblau 25 % (w/v), Xylenxyanol 25 % (w/v). |
Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurde die gewünschte Bande aus dem Gel ausgeschnitten und mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen) nach den Angaben des Herstellers aufgereinigt.
Sequenzierungen wurden mit dem PRISM dye Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Proben wurden wie folgt vorbereitet: 600 ng DNS wurden mit 8 µ1 Terminatormix und 1 µl Oligonukleotid (2 pmol/µ1) in 20 µl Reationsvolumen 1 min bei 94 °C denaturiert und dann in 25 Zyklen (je 10 s bei 96 °C, 5 s bei 50 °C und 4 min bei 60 °C) amplifiziert. Nach Ethanolfällung erfolgte die weitere Analyse am Institut für Zellbiochemie und molekulare Neurobiologie (Lab. Prof Richter).
1 µl Template wurde in einem Volumen von 50 µl PCR-Puffer (Ix; Pharmacia Biotech) mit 1 µM 5' Oligonukleotidnukleotid, 1 µM 3' Oligonukleotidnukleotid, 250 µM DNS Polymerisierungsmix (dNTPs), 10 mM KCI sowie 5 u Taq Polymerase (Pharmacia Biotech) in einem Gene Amp PCR System 2400 Thennocycler (Perkin Elmer) zunächst 2 min bei 94 °C denaturiert und dann in 30 Zyklen (je 30 s Denaturierung bei 94 °C, 30 s Anlagerung der Oligonukleotidnukleotidprimer bei 55 °C und 45 s Extension bei 72 °C) amplifiziert. Nach 10 min abschließender Extension bei 72 °C wurde der Ansatz auf 4 °C gekühlt. Die Analyse der PCR-Produkte erfolgte durch Agarosegelelektrophorese auf 0,8 % bis 2 % Gelen.
Nach Entfernen des Wachstumsmediums wurden die Zellen mit 500 µl Guanidiumthiocyanat (GTC) 4 M mit 1 % Mercapoethanol (v/v) überschichtet und durch mehrfaches Aufziehen in einer Pipette lysiert. Das Lysat wurde in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und die enthaltene genomische DNS mit Hilfe einer Kanüle durch Scherkräfte zerstört ("shearing"). Der Ansatz wurde mit 150 µl L-Sarkosyl (40%) vermischt und vorsichtig über 3,5 ml in ein Ultrazentrifugenröhrchen vorgelegte CsC1Lösung geschichtet. Nach Zentrifugation für 20 h bei 18 °C mit 32000 Upm in einer J2HC Zentrifuge (Beckmann) wurde der Überstand abgenommen, das RNS-Pellet luftgetrocknet und in 80 µl Wasser aufgenommen.
CsCI-Lösung | CsC1 5,7 M, EDTA 100 mM |
In 20 µl Oligonukleotidnukleotid Extensionspuffer (Ix) wurden 10 µg RNS mit 500 nM dNTPs und 4 pM antisense-Oligonukleotidnukleotid Apo B2 (Sequenz s.u. 6.) zunächst 10 min bei 65 °C denaturiert. Die Anlagerung des Oligonukleotidnukleotids erfolgte bei 42 °C für 5 min. Zur Synthese der CDNS wurden 9 µl des Ansatzes mit 1 µl Reverser Transkriptase (2 u; Pharmacia Biotech) versetzt und 1 h bei 42 °C inkubiert. Als Kontrolle diente eine Reaktion ohne Reverse Transkriptase.
Oligo-Extensionspuffer | Tris-HCI (pH 8,0) 500 nM, M9C12 60 mM, DTT 100 mm. |
Die CDNS wurde in einem Volumen von 50 µl in PCR-Puffer (Ix) mit 250 µM dNTPs, 4 pM sense-Oligonukleotidnukleotid Apo Bl (Sequenz s.u. 6.), 10 mM KCI, 5 u Taq DNS Polymerase in 25 Zyklen (1 min 92 °C, 2 min 52 °C, 2 min 72 °C) amplifiziert. 5 ktl des PCR-Produktes wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
RT-PCR-Produkte wurden zunächst über Mikrospin-Säulen aufgereinigt, um Oligonukleotide und dNTPs zu entfernen. 50 ng PCR-Produkt wurden in 10 µl Primer Extensionspuffer (1x) mit 500 nM 3dNTP, 500 nM ddGTP und 100fM des 32p-markierten Oligonukleotidnukleotids DD3 (Sequenz s.u. 6.) 10 min bei 95 °C denaturiert. Die Probe wurde zur Anlagerung des Oligonukleotidnukleotids 5 min auf 42 °C gehalten, 1 µl (2 u) Reverse Transkriptase zugegeben und 1 h bei 42 °C extendiert. Das resultierende Produkt ist als Folge der C/U Deaminierung durch Apobec-1 bei editierter cDNS 43 Nukleotide, bei nicht editierter cDNS 54 Nukleotide lang. Die Analyse der Extensionsprodukte erfolgte nach Größenauftrennung auf einem 8 % Ployacrylamid-Sequenziergel (7 M Harnstoff) durch Autoradiographie bei -80 °C über Nacht.
In einem Reaktionsansatz aus 8 % Acrylamid und 50 g Hamstoff in TBE (Ix) wird durch Zugabe von l ml Ammoniumpersulfat und 70 µl TEMED die Polymerisierung induziert. Der Ansatz wird blasenfrei zwischen zwei mit Ethanol gereinigte und mit Sigmacote (Sigma) behandelte Glasplatten gefällt. Nach Einlage der Geltaschenformer härtet das Gel ca. 30 min aus. Es wird in eine S2-Gelkanimer (Life Technologies) gespannt und TBE als Laufpuffer aufgefüllt. Die Proben werden in Ladepuffer für SDS-PAGE (1x) aufgetragen.
Ladepuffer für SDS-PAGE (5x) | Tris-HCI (pH 6,8) 5 M 20 % (v/v), SDS 2 %, Glyzerin 20 %, ß-Mercaptoethanol 10 %. |
Zur funktionellen Charakterisierung der Apobec-1 Promoter wurden serielle Deletionen der Promoterregionen hergestellt. Dabei handelt es sich um die 5' von Exon 1 (Leberpromoter, LP) und Exon 2 (Dünndannpromoter, IP) gelegenen Bereiche. LP lag in Form von zwei 2,0 kb (pLP2) bzw. 2,5 kb (pLP5) langen Fragmenten innerhalb eines pGEM-T-Vektors (Promega) vor. pGEM-T ist ein linearisierter Expressionsvektor für PCR-Produkte, an dessen 3'-Enden Thymidine angehängt wurden. Dies erleichtert die Ligation mit PCR-Produkten, da die Taq-Polymerase unabhängig von der Kopiervorlage dem synthetisierten Strang ein einzelnes 3'-Deoxyadenosin hinzufü,gt.
Abbildung 1: pGEM-T Vektor (Promega)
pLP2 und pLP5 wurden mit Sal 1, der Luziferase-Reporter-Vektor pGL3Basic-Vektor (Promega) mit Xho 1 hydrolysiert. Aufreinigung, Ligation und Transfonnation wurden wie oben beschrieben durchgeführt. In die 5' des Luziferasegens gelegene MCS von pGL3Basic können Promoterkandidaten kloniert werden, die in Abwesenheit eines plasmideigenen Promoters die Expression von Luziferase steuern.
Abbildung 2: pGL3 Basic Vektor (Promega).
Um eine Religation des Vektors zu verhindern, wurde vor der Ligation der Promoterfragmente in den linearisierten Vektor eine Abspaltung der 5' Phosphate mit CIP durchgeführt. Die DNS der entstandenen Klone wurde durch Hydrolyse mit Restriktionsendonukleasen auf Vorhandensein (Hind III und Sac I) und Orientierung der Fragmente (Nco I und Spe I) überprüft. Das aus pLP5 entstandene Konstrukt wird als LPI bezeichnet und umfaßt den Bereich von -2535 bis +92 von der Transkriptionsstartstelle (ATG). Das aus pLP2 entstandene Konstrukt LP2 umfaßt den Bereich von -2089 bis +92. (s.Abbildung 4).
Der 5' von Exon 2 gelegene Bereich lag als 2 kb langes Fragment ebenfalls innerhalb eines pGEM-T Vektors vor (pll). Es wurde durch Hydrolyse mit Sal I und Nco I isoliert. Der pGL3Basic-Vektor wurde ebenfalls mit Sal I und Nco I hydrolysiert. Durch die unterschiedlichen Schnittstellen war die Orientierung des Fragments im Vektor von vornherein festgelegt ("directional cloning"). Das Konstrukt erhielt den Namen IP1. Es umfaßt den Bereich von -2070 bis +81 bp, gemessen von der Transkriptionsstartstelle (ATG).
Um weitere serielle Deletionen der beiden Promoter herstellen zu können, wurden innerhalb der Sequenzen Bereiche gesucht, die Schnittstellen von Restriktionsendonukleasen entsprachen oder sich nur in einer Base von ihnen unterschieden. Ca. 30 Basen lange Oligonukleotidnukleotidprimer wurden synthetisiert, an deren 3' Ende sich die entsprechende Schnittstelle befand (MS 1-6, MS 1 1- 1 7 Sequenzen s.u. 6). Mit ihnen wurden die folgenden Promoterbereiche amplifiziert:
LP3 (-924 bis +28) MS 1, MS2
LP4 (-496 bis +28) MS1, MS3
LP5 (-140 bis +28) MSI, MS4
LP6 (-63 bis +28) MSI, MS5
LP7 (-20 bis +28) MS1, MS6
(s. Abbildung 3)
IP2 (-1167 bis +63) MS 11, MS12
1P3 (-581 bis +63) MS 11, MS 13
IP4 (-318 bis +63) MS 11, MS 14
IP5 (-216 bis +63) MS 11, MS 15
IP6 (-161 bis +63) MS 11, MS 16
IP7 (-52 bis +63) MS 11, MS 17
(s. Abbildung 5)
Bei allen LP-Konstrukten wurde pLP2 (Leberpromoter), bei allen IP-Konsfrukten pII (intestinaler Promoter) als Template verwendet. Die Längenangaben beziehen sich auf die jeweilige Transkriptionsstartstelle (ATG). Minus bezeichnet 5' gelegene, plus 3' gelegene Nukleotide. Die PCR-Produkte wurden in den pGEM-T-Vektor ligiert und die PlasmidDNS der entstandenen Klone durch Hydrolyse mit Nco I und Sal I auf Vorhandensein der Promoterbereiche überprüft.
Nach Hydrolyse mit Sal I und Hind III und Aufreinigung wurden die Promoterfragmente in einen mit Xho I und Hind III hydrolysierten pGL3Basic Vektor ligiert (directional cloning).
Nach Hydrolyse mit Hind III und Aufreinigung wurden die Promoterfragmente in den ebenfalls mit Hind III hydrolysierten pGL3-Basic-Vektor ligiert.
Das Promoterfragment wurde durch Hydrolyse mit Sal I isoliert, aufgereinigt und in einen mit Xho I hydrolysierten, C1P7behandelten pGL3-Basic-Vektor ligiert. Die richtige Orientierung wurde durch Hydrolyse mit Not I und Sac I nachgewiesen.
Die Promoterfragmente wurden durch Sac I- und Bgl II-Hydrolyse isoliert und in einen mit den gleichen Restriktionsendonukleasen behandelten pGL3-Basic-Vektor ligiert.
Bei den nicht richtungsgebundenen Klonierungen von LP1 und 1P2 entstanden auch Konstrukte, die das Promoterinsert in umgekehrter Orientierung enthielten.
Durch PCR mit dem vektorspezifischen sense-Oligonukleotidnukleotid SP6 und den antisense-Oligonukleotidnukleotiden MS22 und MS23 (Sequenzen s.u. 6.) wurden die folgenden Bereiche des intestinalen Promoters ainplifiziert:
-2070 bis -1 145 (SP6, MS22)
-2070 bis -557 (SP6, MS23)
Die PCR-Produkte wurden über ein Agarosegel aufgereinigt, mit Sac I hydrolysiert und vor das Promoterfragment des ebenfalls mit Sac I hydrolysierten und CIP-behandelten Konstruktes IP5 ligiert. Die so entstandenen Deletionskonstrukte entsprechen IP1 ohne die Bereiche -1144 bis -216(IPΔ(1144-216)) bzw. -556 bis -216 (IPΔ(556-216)) (s. Abbildung 8).
Folgende Bereiche des intestinalen Promoters wurden amplifiziert:
-1167 bis -266 (MS12, MS22)
-581 bis -266 (MS13, MS22)
-318 bis -266 (MS14, MS22)
Die PCR-Produkte wurden in den pGEM-T-Vektor kloniert und ihre Orientierung überprüft. Nach Hydrolyse mit Sac I und Nhe I und Aufreinigung wurden sie vor das Promoterfragment des mit den gleichen Endonukleasen hydrolysierten LP5-Konstruktes ligiert. Die Konstrukte erhielten die Namen IP(1167-266)LP5, IP(518-266)LP5 und IP(318-266)LP5 (s. Abbildung 9).
Die vollständige Apobec-1 cDNS der Ratte lag innerhalb eines pT7T3 Vektors (Promega) vor. Eine SV40 small T antigen site und eine SV40 early polyadenylation site lagen 3' des Apobec-1 Gens. Um dieses Konstrukt durch einen Apobec-1-eigenen Promoter zu einem Apobec-1-Minigen zu vervollständigen, wurde der etwa 2000 kb lange, 5' des ersten Exons gelegene Promoterbereich (LP) mit Sal I aus dem pGEM-T Vector isoliert, aufgereinigt und in das ebenfalls mit Sal I hydrolysierte, mit CIP behandelte pT7T3-Apobec-1-SV4O-Konstrukt ligiert. Die erfolgreiche Klonierung und richtige Orientierung wurden durch Hydrolysen mit Sal I bzw. Sph I nachgewiesen (s. Abbildung 12).
Die Zellen wurden zügig aufgetaut, in 10 ml 37 °C warmem Wachstumsmedium aufgenommen und bei 1000 Upm 4 min abzentrifugiert. Der DMSO-haltige Überstand wurde entfernt, die Zellen in einem angemessenen Volumen Medium resuspendiert und in eine Zellkulturflasche überführt.
Zellen wurden bei 37 °C, 5 % CO2, in wasserdampfgesätiger Luft im Brutschrank (B12, Heraeus) gehalten. Für HuH7 (humane Hepatomzellinie) und NIH3T3 (murine Fibroblastenzellinie) wurde im Wachstumsmedium eine FKS-Konzentration von 10 % gewählt, für CaCo2 (humane Kolonkarzinomzellinie; freundlicherweise von Dr. C. Courtelle, London, GB, zur Verfügung gestellt) 20 %. Das Wachstumsmedium wurde alle 2 bis 4 Tage erneuert.
Wachstumsmedium | Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 10/20 % fötales Kälberserum (FKS) |
Von konfluent gewachsenen Zellen wurde das Wachstumsmedium entfernt, mit 37 °C warmem PBS gewaschen und mit 2 ml Trypsin-EDTA inkubiert. Durch Schütteln der Flasche wurden die Zellen abgelöst, sofort in 37 °C warmem Wachstumsmedium resuspendiert und in eine frische Zellkulturflasche überführt. Je nach Zellinie wurde zwischen 1:3 (NIH3T3) und 1:8 (CaCo2) verdünnt.
Adhähente Zellen wurden mit Trypsin-EDTA abgelöst, 5 min bei 1000 Upm pelletiert, in kühlem Einfriermedium resuspendiert und in kältebeständige Kryo-Röhrchen überführt. Anschließend wurden sie über Nacht in einem Styroporblock langsam auf -20 °C abgekühlt und dann.bei -80 °C aufbewahrt.
Einfriermedium für Zellen | FKS 50 %, DMEM 40 %, DMSO 10 |
Zur transienten Transfektion wurden kationische Liposomenpräparate verwendet, die mit Plasmid-DNS spontan Komplexe bilden und in serumfreiem Medium mit eukaryontischen Zellen fusionieren. Dabei wird Plasmid-DNS von den Zellen aufgenommen und die darauf kodierten Proteine exprimiert. Transfektionen wurden auf 6-well-Zellkulturplatten mit 2x105 adhärenten und zu 40-60 % konfluenten Zellen in dreifachem Ansatz durchgeführt, um Schwankungen der Transfektionseffizienz zu nivellieren. Pro Well wurden 2,3 µg Plasmid-DNS in 100 µg serumfreiem Medium (OptiMEM 1, Gibco) angesetzt; 2 µg Konstruktvektor sowie 0,3 µg β-Galaktosidase-Referenzvektor (CMV-β-Gal). Dieser Vektor enthält das vom Cytomegalievirus(CMV)-Promoter gesteuerte β-GalaktosidaseGen. Ein zweiter Ansatz enthielt 18 µl Lipofectin Reagent (Life Technologies) in 100 µl serumfreiem Medium. Nach 30 min wurden die Ansätze gemischt und nochmals 15 min inkubiert. Währenddessen wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Unmittelbar vor der Transfektion wurden die Ansätze mit 800 µl serumfreiem Medium aufgefüllt und über die Zellen geschichtet. Nach 8 h wurde der Transfektionsansatz durch 2 ml Wachstumsmedium ersetzt; nach weiteren 48 h wurden die Zellen lysiert und analysiert.
Nach der Transfektion wurden die Zellen mit hormonhaltigem Wachstumsmedium überschichtet (Insulin 10 nM, Triiodthyronin 50 nM, Dexamethason 100 nM, Glucagon 5 nM, Östradiol 50 nM, Somatotropes Hormon 50 n-M (alle Sigma)). Als Referenz dienten Transfektionen mit normalem Wachstumsmedium. Neben den einzelnen Hormonen wurde mit den Hormonkombinationen Dexamethason und Insulin, Dexamethason und Triiodthyronin sowie Insulin und Triiodthyronin stimuliert.
Um die Effizienz einer Transfektionsmethode zu bestimmen, wurde mit der oben beschriebenen Methode und einer Kontrollmethode (SuperFect) der CMV-β-Gal-Vektor in HuH7-Zellen transfiziert. Nach 48 h wurde das Medium abgenommen, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und 15 min mit 2 ml Glutaraldehydlösung (0,25 % in PBS) fixiert.
Um Glutaraldehyd zu entfernen, das β-Galaktosidase inhibiert, wurde dreimal mit PBS gewaschen, die Zellen mit 1 ml X-Gal-Färbelösung überschichtet und je nach vorhandener β-Galaktosidase-Menge 30 min bis 16 h bei 37 °C inkubiert.
X-Gal-Färbelösung | X-Gal 0,2 % (W/V), MgCl2 2 mM, K4Fe(CN)6 5 mM, K3Fe(CN)6 5 mM, in PBS (1x). |
Die Lyse wurde mit Reporter Lysis Buffer (Promega) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen mit 400 µl Reporter Lysis Buffer (1x) 15 min lysiert, mit einem einmal-Cell-Scraper gelöst, in ein Reaktionsgefäß überführt und im folgenden auf Eis gehalten. Die Lysate wurden 15 s geschüttelt, auf Trockeneis gefroren, wieder aufgetaut, und in einer auf 4 °C gekühlten Zentrifuge 2 min bei 15000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und bei -70 °C aufbewahrt.
Die Luziferase-Aktivität wurde mit dem Luciferase Assay System (Promega) nach den Angaben des Herstellers gemessen. Die Lichtemission von 10 µl Zellysat wurden nach Zugabe von 50 µl Luziferase Assay Reagent und 2 s Äquilibrierungszeit in einer 96-well-Platte im Luminometer 60 s gemessen. Als Positivkontrolle dienten Lysate von mit pGL3Control-Vektor transfizierten Zellen, als Negativkontrolle Lysate von mit pGL3-BasicVektor transfizierten sowie von nicht transfizierten Zellen.
β-Galaktosidase-Aktivität wurde mit dem Galacto-Light-Plus Chemoluminescent Reporter Assay (Tropix) nach Angaben des Herstellers analysiert. 10 µl Zellysat wurden auf einer 96-well-Platte mit 35 µl Reaktionspuffer (1x) 60 min inkubiert. Die Lichtemission wurde nach Zugabe von 50 µl Light Emission Accellerator und 2 s Äquilibrierungszeit im Luminometer 2 s gemessen. Als Kontrolle dienten Lysate von nicht transfizierten Zellen.
Jede Transfektion wurde mindestens dreimal ausgeführt und enthielt drei voneinander unabhängige Ansätze für jedes Promoterkonstrukt, die getrennt voneinander transfiziert und analysiert wurden. Als interne Kontrolle wurde jedem Transfektionsansatz eine konstante Menge CMV-β-Gal-Plasmid hinzugefügt. Durch Quotientenbildung der Werte Luziferase/β-Galaktosidase wurden durch schwankende Transfektionseffizienz bedingte Unterschiede der Luziferaseexpression ausgeglichen. Dieser Quotient wurde bei jedem der drei Transfektionsansätzte eines Konstruktes errechnet, bevor der Mittelwert aus ihnen gebildet wurde. Um die Mittelwerte mit denen anderer Transfektionen vergleichen zu können, wurden sie als Vielfaches des jeweiligen Basisvektorwertes ausgedruckt. Aus mindestens drei unabhängigen Transfektionen wurden Mittelwerte und SEM (Standard Error of the Mean) errechnet.
Mittelwert:
(Summe der Werte einer Reihe geteilt durch die Zahl der Werte in der Reihe).
SEM (Standard Error of the Mean):
(Standardabweichung geteilt durch Wurzel aus n (Zahl der Werte in einer Reihe Zahl der unabhängigen Experimente)
Standardabweichung ist die positive Quadratwurzel der Varianz:
wobei die Varianz die Summe der quadrierten Abweichungen vom Mittelwert geteilt durch die Zahl der Werte minus eins ist:
Bezeichnung | Sequenz | Herkunft |
---|---|---|
MS1 | CAC AAG CTT CCT GAC CAG AGA AAG CTG AGG | Apobec 1-LeberPromoter der Ratte, antisense, Hind III-Schnittstelle |
MS 2 | GAA GTC GAC TTC CAT TTT GAT AGA GGT CAG | LeberPromoter, sense, Sal I-Schnittstelle |
MS 3 | ACC GTC GAC TGT TTT TCA GTC ATC TGG ACT | LeberPromoter, sense, Sal I-Schnittstelle |
MS 4 | AAG CGG CTG AAT GTC GAC AAC AAC AAT AAC | LeberPromoter, sense, Sal I-Schnittstelle |
MS 5 | GCG AGC TCG CCT GAC AAA CCC CAG CCA | LeberPromoter, sense, Sac I-Schnittstelle |
MS 6 | GCG AGC TCT TAA AGC CGA ACC AGC AA | LeberPromoter, sense, Sac I-Schnittstelle |
MS 11 | TGT AGA TCT GGA CTC CTT CCT TCC TCG GGA | Apobec 1-DünndarmPromoter der Ratte, antisense, Bgl II-Schnittstelle |
MS 12 | TTT GTC GAC TGA TGA TTG GTG TGG GAG TGC | DünndarmPromoter, sense, Sal I-Schnittstelle |
MS 13 | GAA GTC GAC CCA ACG TTC TGG CAA CAG AAG | DünndarmPromoter, sense, Sal I-Schnittstelle |
MS 14 | CCT GTC GAC TTC TTA GAT ATA GGA GCT | DünndarmPromoter, sense, Sal I-Schnittstelle |
MS 15 | GCG AGC TCT GGA ATT TAA CAT CAT CGA TG | DünndarmPromoter, sense, Sac I-Schnittstelle |
MS 16 | GCG AGC TCT CTC CAG GGA GGA CGG AAA TC | DünndarmPromoter, sense, Sac I-Schnittstelle |
MS 17 | TGG AGC TCA GGA ATG AGT CAT CCT GT | DünndarmPromoter, sense, Sac I-Schnittstelle |
MS 22 | GCG AGC TCG CAC TCC CAC ACC AAT CAT CAG TC | DünndannPromoter, antisense, Sac I-Schnittstelle |
MS 23 | GCG AGC TCT CTT CTG TTG CCA GAA CGT TGG G | DünndarmPromoter, antisense, Sac I-Schnittstelle |
SP 6 | ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACT CAA G | pGEM-T-Vektor 5' der MCS, sense |
Apo BI | CTG ACT GCT CTC ACA AAA AAG TAT AGA | humane Apo B cDNS, sense, Nukleotide 6552 bis 6578 |
Apo B2 | CAC GGA TAT GAT AGT GCT CAT CAA GAC | humane Apo B cDNS, antisense, Nukleotide 6786 bis 6760 |
DD 3 | A ATC ATG TAA ATC ATA ACT ATC TTT AAT ATA CTG A | humane Apo B cDNS, antisense, Nukleotide 6708 bis 6674 |
(Oligonukleotidnukleotidprimer wurden durch das Labor von Prof. Richter, Institut für Zellbiochemie und molekulare Neurobiologie, synthetisiert)