der Medizinischen Klinik
des Universitätskrankenhauses Hamburg-Eppendorf
Direktor: Prof. Dr. med. C. Wagener
Molekulargenetische Untersuchungen
zur präsymptomatischen Diagnostik einer Familie mit klinisch manifestem
Lynch-Syndrom (HNPCC)
D i s s e r t a t i o n
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg
vorgelegt von
Christian Spies
aus Frankfurt/Main
Hamburg 1999
Angenommen von dem Fachbereich Medizin
der Universität Hamburg am:
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs
Medizin der Universität Hamburg
Sprecher:
Referent:
Korreferent:
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Das kolorektale Karzinom 1
1.1.1 Die Karzinogenese des kolorektalen Karzinoms 2
1.1.2 Sporadische und familiäre Formen von Darmkrebs 4
1.2 DNA-Reparatursysteme 6
1.2.1 Das Mismatch-Reparatur-System 7
1.3 Das Lynch-Syndrom (HNPCC) 10
1.3.1 Die Karzinogenese des Lynch-Syndroms 11
1.3.2 Prädisponierende Mutationen 13
1.3.3 Früherkennung bei HNPCC-Risikofamilien 14
1.3.4 Methodische Überlegungen zu genetischen Untersuchungen 15
1.4 Problemstellung und Ziel der Arbeit 17
2 Material und Methoden 19
2.1 Materialien 19
2.1.1 Chemikalien 19
2.1.2 Enzyme 20
2.1.3 Allgemeine Labormaterialien 20
2.1.4 Geräte 21
2.2 Lösungen und Kulturmedien 22
2.3 Arbeitsmethoden 24
2.3.1 Isolierung von Nukleinsäuren 24
2.3.1.1 RNA-Präparation aus Lymphozyten 24
2.3.1.2 DNA-Präparation aus Vollblut 24
2.3.1.3 DNA-Isolierung aus Gewebeproben 25
2.3.2 Oligonukleotid-Synthese 25
2.3.3 Konzentrationsbestimmung von Primern 26
2.3.4 Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA 26
2.3.5 cDNA-Synthese 27
2.3.6 Polymerasekettenreaktion 28
2.3.6.1 Primer zur Amplifikation von cDNA-Fragmenten 29
2.3.6.2 Primer zur genomischen Amplifikation 32
2.3.6.3 PCR-Bedingungen für die Amplifikation von cDNA 34
2.3.6.4 PCR-Bedingungen für die Amplifikation genomischer DNA 36
2.3.7 Reinigung von Nukleinsäuren 37
2.3.7.1 Phenolextraktion 37
2.3.7.2 Alkoholische Präzipitation 37
2.3.7.3 Reinigung von PCR-Produkten 37
2.3.8 Hydrolyse von DNA mittels Restriktionsendonukleasen 38
2.3.9 Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 38
2.3.10 Heteroduplexanalyse 39
2.3.11 IVSP-Assay 39
2.3.12 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese von Proteinen 41
2.3.13 SSCP-Analyse 41
2.3.14 Silberfärbung von Acrylamidgelen 42
2.3.15 Klonierung von PCR-Produkten 42
2.3.15.1 Ligation von PCR-Produkten 42
2.3.15.2 Transformation kompetenter Bakterien 43
2.3.15.3 Blau/Weiß Selektion von Bakterienkolonien 44
2.3.15.4 „Colony-Screening" 44
2.3.15.5 Zwischenkultur von Bakterienklonen 46
2.3.16 Isolation von Plasmid-DNA 46
2.3.17 DNA-Sequenzierung 47
2.3.18 RFLP-Analyse 49
2.3.19 Bestimmung des Mikrostallitenstatus 50
2.4 Probenmaterial 51
3 Ergebnisse 52
3.1 Nachweis von Spleißvarianten in hMLH1 52
3.2 Mutationsanalytik auf cDNA-Ebene 55
3.2.1 Heteroduplexanalyse von hMSH2 55
3.2.2 IVSP-Assay 57
3.3 Mutationsdetektion auf genomischer Ebene 60
3.3.1 SSCP-Analyse von hMSH2 und hMLH1 61
3.3.2 Klonierung aller Exons von hMSH2 und hMLH1 64
3.3.3 Sequenzierung der Klone von hMSH2 und hMLH1 65
3.4 Familienscreening mittels RFLP-Analyse 68
3.5 Mikrosatelliten-Untersuchungen 71
4 Diskussion 73
4.1 Identifizierung der Mutation 73
4.1.1 Der funktionelle Aspekt der Mutation 75
4.1.2 Auswahl und Einflüsse der analytischen Systems 76
4.2 Nebenbefunde 79
4.2.1 Polymorphismen 79
4.2.2 Spleißvarianten 81
4.3 Familienscreening 82
4.4 Überlegungen zu genetischen Tests und Beratungen 85
5 Zusammenfassung 87
6 Literaturverzeichnis 88
Anhang
Abkürzungen
°C | Grad Celsius |
abs. | absolut |
APS | Ammoniumpersulfat |
bp | Basenpaar |
BSA | bovines Serumalbumin |
Ci | Curie |
cpm | Zerfälle pro Minute (counts per minute) |
ddH2O | doppelt destilliertes Wasser |
ddNTPs | 2‘,3‘-Didesoxynukleotide |
DNA | Desoxyribonukleinsäure („deoxyribonucleic acid") |
dNTPs | Desoxynukleotide |
dsDNA | doppelsträngige DNA |
EDTA | Ethylendiamintetraessigsäure |
GIT | Guanidinumisothiocyanat |
HNPCC | vererbtes nicht-polypöses kolorektales
Karzinom
(„hereditary non-polyposis colorectal cancer") |
IVSP | In vitro synthetisiertes Protein (=„Protein Truncation Test" (PTT)) |
kDa | Kilodalton |
min | Minute |
PAGE | Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese |
PCR | Polymerasekettenreaktion („polymerase chain reaction") |
RFLP | Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus |
RNA | Ribonukleinsäure („ribonucleic acid") |
rpm | Umdrehungen pro Minute („rounds per minute") |
RT | Raumtemperatur |
RT-PCR | Reverse Transkriptase PCR |
s | Sekunde |
SDS | Natriumdodecylsulfat („sodium dodecyl sulfate") |
SSCP | Einzelstrang-Konformationspolymorphismus
(„Single-Stranded-Conformation-Polymorphism") |
TEMED | N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin |
TM | Schmelztemperatur |
U | Einheit („unit") |
X-Gal | 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b -D-Galactopyranosid |