2 Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien
1 kb DNA-Längenstandard |
Gibco BRL (Eggenstein) |
10 bp DNA-Längenstandard |
Gibco BRL (Eggenstein) |
100 bp DNA-Längenstandard |
Gibco BRL (Eggenstein) |
a S35-Methionin |
ICN (Meckenheim) |
Acrylamid-Bisacrylamid 19:1 (w/v) |
Serva (Heidelberg) |
Agarose |
Biozym (Hess. Oldendorf) |
Ammoniumpersulfat |
Bio Rad (München) |
Ampicillin |
Sigma (Deisenhofen) |
Bacto-Agar |
Difco (Detroit, USA) |
Bacto-Tryptone |
Difco (Detroit, USA) |
Bacto-Yeast Extract |
Difco (Detroit, USA) |
b -Mercaptoethanol |
Serva (Heidelberg) |
Bromphenolblau |
Merck (Darmstadt) |
BSA |
NEB (Schwalbach) |
dNTPs |
Phamacia (Freiburg) |
EDTA-Na2 |
Merck (Darmstadt) |
Ethidiumbromid |
Merck (Darmstadt) |
Ficoll-Paque |
Phamacia (Freiburg) |
g P32-ATP |
NEN (Brüssel, Belgien) |
Glycerol |
Merck (Darmstadt) |
Glykogen |
Boehringer (Mannheim) |
Guanidiniumisothiocyanat (GIT) |
Fluka (Neu-Ulm) |
Kanamycin |
ICN (Meckenheim) |
MDEâ -Acrylamidlösung (2x) |
FMC (Rockland, USA) |
Mineralöl |
Sigma (Deisenhofen) |
Nonidetâ P 40 (NP 40) |
Fluka (Neu-Ulm) |
Phenol (Trisâ -gepuffert, pH 8,0) |
USB (Braunschweig) |
Rainbow-Protein-Längenstandard |
Amersham (Braunschweig) |
Random Hexamere |
USB (Braunschweig) |
Rapid-hyb-buffer |
Amersham (Braunschweig) |
Silberfärbung (Silver Stain und Silver Stain Plus) |
Bio Rad (München) |
SDS |
Sigma (Deisenhofen) |
TEMED |
Bio Rad (München) |
Trisâ (ultrapure) |
ICN (Meckenheim) |
Trizol |
Gibco BRL (Eggenstein) |
X-Gal |
Biomol (Hamburg) |
Xylencyanol FF |
Serva (Heidelberg) |
2.1.2 Enzyme
Amplitaq DNA-Polymerase, FS |
Perkin Elmer (Langen) |
Amplitaq Gold DNA-Polymerase |
Perkin Elmer (Langen) |
Proteinase K |
Sigma (Deisenhofen) |
Restriktionsendonukleasen |
NEB (Schwalbach) und |
RNAse Inhibitor |
Boehringer (Mannheim) |
RNAse, DNAse-frei |
Boehringer (Mannheim) |
rTth-DNA Polymerase |
Perkin Elmer (Langen) |
Superscript II |
Gibco BRL (Eggenstein) |
T4-DNA-Ligase |
Invitrogen (NV Leek, NL) |
T4-Polynukleotid Kinase |
NEB (Schwalbach) |
T7-RNA-Polymerase |
Promega (Madison, USA) |
Taq DNA-Polymerase |
Gibco BRL (Eggenstein) |
2.1.3 Allgemeine Labormaterialien
0,5-2 ml Reaktionsgefäße |
Eppendorf (Hamburg) |
15-50 ml Reaktionsgefäße |
Eppendorf (Hamburg) |
centriconâ 100 |
Amicon (Witten) |
Filterpapier 3MM |
Schleicher und Schüll (Dassel) |
„Glasmax spin cartridge" system |
Gibco BRL (Eggenstein) |
NAPâ -5 Säulen |
Pharmacia (Brüssel) |
NAPâ -10 Säulen |
Pharmacia (Brüssel) |
Nitrozelluloserundfilter BA 85 |
Schleicher und Schüll (Dassel) |
Plastikartikel (Pipettenspitzen, Pipetten, Petrischalen) |
Eppendorf (Hamburg), Biozym (Hess. Oldendorf), Falcon (Heidelberg), Greiner (Frickenhausen) |
Röntgenfilm (Hyperfilm MP) |
Amersham (Braunschweig) |
2.1.4 Geräte
400 mm Acrylamidgel-Aparatur |
Cti (Idstein) |
Agarosegelkammern |
Hoefer (San Francisco, USA) |
Autoklav |
Tecnomara (Fernwald) |
Fotoapparatur und Filme für Agarosegele |
Polaroid (Cambridge, USA) |
Gel-Trockner |
Hoefer (San Francisco, USA) |
Gene Assembler Plus |
Pharmacia (Freiburg) |
Heizblock |
Techne (Cambridge, UK) |
Hybridisierungsofen |
GFL (Burgwedel) |
Inkubationsofen |
Heraeus (Hanau) |
Inkubationsschüttler |
CLF (Emersacker) |
Mikroskop |
Zeiss (Oberkochen) |
pH-Meter |
Beckmann (München) |
Pipetten (10, 100 und 1000 µl) |
Eppendorf (Hamburg) |
Proteingelkammern |
Biometra (Göttingen) |
Röntgenfilmkassette |
Amersham (Braunschweig) |
Spannungsgeräte |
Pharmacia (Freiburg) |
SpeedVac (Vakuumzentrifuge) |
Savant (Hicksville, USA) |
Standzentrifugen |
Hermle (Gosheim) und Sorvall, Du Pont (Bad Homburg) |
Szintillationszähler (Tri-Carb) |
Canberra Packard (Frankfurt) |
Thermocycler (Minicycler) |
Biozym (Hess. Oldendorf) |
Tischzentrifugen |
Heraeus (Hanau) und Eppendorf (Hamburg) |
UV-Spektrophotometer |
Shimadzu (Duisburg) |
Vakuumofen |
Elektro-Wärme (Aachen) |
Vortexer |
Braun (Melsungen) |
Waagen |
Mettler (Gießen) |
2.2 Lösungen und Kulturmedien
Ammoniumpersulfat |
10% (w/v) Ammoniumpersulfat |
Denaturierendes Polyacrylamidgel |
6.7% (w/v) Acylamid/Bis 1:19 |
Heteroduplexgel |
50% (v/v) MDE-Solution (2x) |
Ladepuffer für Agarosegelelektrophoresen |
0.04% (w/v) Bromphenolblau |
Ladepuffer für Heteroduplexgele |
0.04% (w/v) Orange G |
LB-Agarplatten |
15 g/l Bacto-Agar |
LB-Medium |
10 g/l Bacto-Tryptone |
Phenol-Chloroform (für DNA Extraktion) |
50% (v/v) Phenol |
Proteinase K Puffer |
50 mM Trisâ -HCl |
Sammelgel |
5% (w/v) Acrylamid |
SDS Probenpuffer für Proteingele |
20% (v/v) Glycerol |
SDS-Laufpuffer für Proteingele |
19.2 mM Glycin |
SOC-Medium |
2% (w/v) Tryptone |
SSC-Lösung (1x) |
150 mM NaCl |
SSCP-Gel |
30% (v/v) MDE-Solution (2x) |
Stop-Lösung für SSCP-Gele |
95% (v/v) Formamid |
TBE-Puffer |
90 mM Trisâ -Borat |
TE-Puffer |
10 mM Trisâ -HCl |
Trenngel |
12.5%-15% (w/v) Acrylamid |
2.3 Arbeitsmethoden
2.3.1 Isolierung von Nukleinsäuren
2.3.1.1 RNA-Präparation aus Lymphozyten
Über 8 ml Ficoll wurde vorsichtig 4 ml Vollblut geschichtet. Für
30 min wurde dann bei 1500 rpm (RT) im „Swing-out"-Rotor zentrifugiert,
danach die obere Serumschicht abgehoben und verworfen. Der trübe Lymphoztenring
(1,5 bis 2 ml) wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt
und bei 6000 rpm (RT) für 5 min zentrifugiert. Wenn der Überstand
daraufhin noch trüb war, wurde nochmals bei 8000 rpm für 5 min
zentrifugiert. Nachdem der Überstand verworfen, und 500 µl Trizol
zum Lysieren der Zellen dazugegeben wurde, konnte die Suspension durchgemischt
werden. Nach Zusetzen von 100 µl Chloroform wurde der Reaktionsansatz
in der Folge für drei Minuten bei RT inkubiert, und für 15 Minuten
bei 12000 g und 4 °C zentrifugiert. Daraufhin bilden sich drei Phasen.
Die obere, ca. 400 µl umfassende, RNA-haltige Phase wurde in ein
neues Reaktionsgefäß überführt und dasselbe Volumen
Isopropanol zugesetzt. Das Gemisch wurde dann bei RT für 10 min inkubiert.
Daraufhin wurde die RNA bei 4 °C und 12000 g für 10 min pelletiert,
um dann das Pellet zweimal mit 1 ml 70%-igem Ethanol zu waschen (7500 g,
4 °C, 5 min). Die RNA wurde dann luftgetrocknet und in 10 bis 50 µl
ddH2O resuspendiert.
2.3.1.2 DNA-Präparation aus Vollblut
Die DNA-Isolierung aus Vollblut erfolgte modifiziert nach Nollau et
al. (1996) mit Hilfe von Glasmembranen [17,152,218]. In ein 1.5 ml Reaktionsgefäß
wurde 20 µl EDTA-Vollblut zusammen mit 50 µl NP 40 und 430
µl 6 M Guanidinumisothiozyanat gegeben und vorsichtig durch leichtes
hin- und herbewegen gemischt. Nachdem das Gemisch für 10 min bei RT
inkubiert worden war, wurde das gesamte Volumen auf die Glasmembran des
„GlassMax spin cartridge" Systems überführt. Für 20 Sekunden
wurde daraufhin bei 14000 rpm (RT) zentrifugiert. Die 500 µl Zentrifugat
wurden dann nochmals auf die Membran pipettiert, und für 20 s bei
14000 rpm (RT) zentrifugiert. Danach wurde zweimal mit 70%-igem Ethanol
gewaschen. Die DNA wurde mit zwei Portionen, je 50 µl 70 °C warmes
ddH2O, eluiert. Dazu wurde jeweils für 20 s bei 14000 rpm
(RT) zentrifugiert.
2.3.1.3 DNA-Isolierung aus Gewebeproben
DNA wurde aus in Formalin fixierten und Paraffin gebetteten Kolontumor-
und Normalkolongewebeproben mit Proteinase K modifiziert nach Jen et al.
(1994) isoliert [83]. Aus einem Gewebeblock wurde ein ungefähr 27
mm3 Stück herausgetrennt, wobei möglichst viel randständiges
Paraffin abgetrennt wurde. Mit einem Skalpell wurde dann das Gewebe möglichst
klein zerteilt und in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt.
Durch Zugabe von 400 µl Xylol wurde das Paraffin aus dem Gewebe herausgelöst.
Dies wird unterstützt durch ausgiebiges Schütteln des inhomogenen
Gemisches für 15 Minuten. Dann wurde der Ansatz bei 14000 rpm (RT)
für 5 Minuten zentrifugiert, und das Xylol abgehoben und verworfen.
Die Schritte der Paraffinextraktion wurden insgesamt viermal durchgeführt.
Das restliche Xylol wurde daraufhin zweimal mit 400 µl Ethanol abs.
und nachfolgender Zentrifugation bei 14000 rpm (RT) für 5 min entfernt.
Bei 37 °C wurde für 15 min das offene Reaktionsgefäß
inkubiert, um eventuell wandhaftenden Ethanol zu eliminieren. Das Pellet
wurde dann in 50 µl Proteinase K Puffer resuspendiert, und soviel
Proteinase K hinzugegeben, daß diese in einer Endkonzentration von
500 µg/ml vorlag. Im Anschluß wurde das Gemisch bei 50 °C
über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde die DNA mit einem
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Gemisch aus dem Lysat extrahiert. Die
wässrige, DNA-enthaltende Phase wurde dann mit Ethanol präzipitiert
und in 70%-igem Ethanol gewaschen. Nach Lufttrocknung wurde das Pellet
in 50 µl ddH2O resuspendiert.
2.3.2 Oligonukleotid-Synthese
Die selbstsynthetisierten Primer für die PCR mit Längen von
18 bis 33 bp sind auf einem Gene Assembler nach der Phosphor-Amidit-Methode
hergestellt worden. Hierbei sind die Kartuschen zunächst für
mindestens 24 h in 1 ml 32%-igem Ammoniak aufbewahrt worden. Gereingt wurde
das Oligonukleotid daraufhin mit einer NAPâ
-10 Säule. Die Säule wurde zunächst mit 6 ml 10 mM Na2HPO4-Puffer
äquilibriert. Daraufhin wurde die Kartusche bei 14000 rpm zum Trocknen
zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde zusammen mit der restlichen Ammoniaklösung
auf die NAPâ -10 Säule gegeben. Zum
eluieren der Primer wurden 1.5 ml 10 mM Natriumhydrogenphosphat-Lösung
auf die Säule gegeben. Für die späteren PCR-Ansätze
wurden die Primer auf eine Konzentration von 5 µM aliquotiert.
2.3.3 Konzentrationsbestimmung von Primern
Oligonukleotidkonzentrationen wurden bei der Wellenlänge von 260 nm und einer Verdünnung von 1:20 bis 1:50 im Spektralphotometer gemessen. Bei bekannter Sequenz ist nach unten genannter Formel die Konzentration bestimmt worden. Da die Extinktion (E260= Extinktion bei 260 nm) des Primers sowohl von der Länge als auch von der Basen- zusammensetzung abhängig ist, wurde die Anzahl der jeweiligen Base mit ihrem entsprechenen Extinktions- koeffizienzfaktor (e ) multipliziert.
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2.3.4 Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA
Die Absorptionsmessungen erfolgten am Spektralphotometer bei den Wellenlängen von 260 nm und 280 nm. Die Konzentration wurden durch folgende Formel ermittelt:
E260* Verdünnung*50 (40) = Konzentration [µg/ml]
Bei zu messender dsDNA muß ein Faktor von 50 und bei RNA der Faktor 40 verwendet werden. Anhand des Quotienten aus E260nm/E280nm ist der Grad der Reinheit abzuschätzen. Dieser Wert sollte für DNA bei ungefähr bei 1.8 bis 2.0 liegen.
2.3.5 cDNA-Synthese
Mit Reverser Transkriptase wurde aus einzelsträngiger, relativ instabiler RNA cDNA hergestellt. In einem 0.5 ml Reaktionsgefäß wurde 500 ng RNA (1-5 µl) mit 150 ng „Random Hexameren" (2µl) versetzt, die als Zufalls- primer die Strangsynthese ermöglichen. Der Ansatz wurde mit ddH2O auf 12 µl aufgefüllt, mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet und für 10 min bei 70 °C inkubiert. Daraufhin wurde der Ansatz sofort auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 4 µl „First strand buffer" (GibcoBRL, Eggenstein), 2 µl 0.1 M DTT (GibcoBRL, Eggenstein) zur Strangstabilisierung und 1 µl dNTPs (10 mM) wurde der Reaktionsansatz auf 25 °C für 5 min äquilibriert. Durch die Zugabe von 1 µl (200 U) Super Script II Reverse Transkriptase wurde die enzymatische Strang- synthese initiiert. Danach wurde der Ansatz für weitere 10 min bei 25 °C gehalten. Daraufhin wurde die Elongation der Strangsynthese bei 42 °C für 50 min durchgeführt. Anschließend wurde das Enzym bei 70 °C für 15 min inaktiviert. Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes von 20 µl wurde daraufhin bei -20 °C gelagert.
2.3.6 Polymerasekettenreaktion
Zur enzymatischen Amplifikation von cDNA und DNA wurde die Polymeraseketten-reaktion (PCR) angewendet [184]. Die Reaktionsansätze hatten ein Gesamtvolumen von 50 µl, außer bei der PCR von Mikrosatelliten, welche in 25 µl Ansätzen amplifiziert wurden. Um Kondensationseffekten vorzubeugen, wurde der Ansatz mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet. Zur Vermeidung von Kontaminationen wurde ausschließlich mit autoklavierten Reaktionsgefäßen und Pipettenspitzen an speziell ausgewiesenen Arbeitsplätzen mit Pipetten, die ausschließlich für die PCR bestimmt waren, gearbeitet. Als Enzyme wurden Taq- , rTth- und Amplitaq Gold DNA-Polymerasen verwendet. Bei der rTth- und teilweise auch bei der Taq-Polymerase wurde ein sogenannter „Hot-Start" durchgeführt, bei dem die Polymerase nach einer Inkubation von 5 min bei 93 °C, bzw. 95 °C zugegeben wurde. Dieses Prinzip ist bei der AmpiTaq Gold automatisch durch eine Inkubation des Ansatzes inklusive Polymerase für 10 min bei 95 °C realisiert worden. Es wurden 40 bis 120 ng DNA eingesetzt. Die Primermenge betrug je Ansatz zwischen 5 und 20 pmol.
rTth Amplitaq Gold Taq
3.3x Puffer 15 µl 10x Puffer 5 µl 10x Puffer 5 µl Mg2+-Acetat 2.2 µl MgCl2 10 µl MgCl2 1.5 µl dNTP`s (10mM) 4 µl dNTP`s (25 mM) 0.4 µl dNTP`s (25 mM) 0.4 µl Primer v 5-20 pmol Primer v 5-15 pmol Primer v 5-20 pmol Primer r 5-20 pmol Primer r 5-15 pmol Primer v 5-20 pmol DNA 40-100 ng DNA 40 ng DNA 40-100 ng rTth 2 U Amplitaq Gold 0.65-1.25 U Taq 1.25 U ddH2O add. 50 µl ddH2O add. 25-50 µl ddH2O add. 50 µl
Tab. 2.1: Reaktionsansätze für die verwendeten DNA-Polymerasen rTth, Taq und Amplitaq Gold. Primer v: Vorwärtsprimer, r: Rückwärtsprimer.
Die Reaktionen wurden, je nach verwendeten Enzym, in einem Minicycler nach folgenden Zyklusprogrammen durchgeführt:
Taq- und Amplitaq Gold Polymerase |
rTth-Polymerase |
Denaturierung 95 °C, 30 s-1.5 min |
Denaturierung 93 °C, 1 min |
Annealing X °C, 30 s-1.5 min |
Annealing und Elongation X °C, 3-5 min |
Elongation 72 °C, 30 s-2.5 min |
|
Die Temperatur der Denaturierung und Elongation ist durch das verwendete Enzym vorgegeben. Die Dauer der Elongation wurde je nach Länge des zu amplifizierenden Fragments gewählt. Die Annealing-Temperatur ist je nach Primersequenz und gewünschter Spezifität der Amplifikation eingestellt worden. Hierbei war die Schmelztemperatur (Tm) der als Primer verwendeten Oligonukleotide ein Anhalt für die vermutlich optimale Annealing-Temperatur. Für die Abschätzung der Schmelztemperatur gilt:
Tm= 4 *N(G+C) + 2 *N(A+T) (N= Anzahl der Basen)
Die hiernach benötigte Annealing-Temperatur liegt 5 °C unter der geschätzten Schmelztemperatur. Dieser Wert ist als Ausgangswert für die dann folgende Optimierung der PCR verwendet worden. Da die Amplifikation mit Hilfe der rTth-Polymerase eine sogenannte Zwei-Schritt-PCR ist, wobei Annealing und Elongation in einem Schritt ablaufen, wurde hier als Ausgangstemperatur für diesen gemeinsamen Schritt lt. Herstellerangaben 60 °C gewählt. Zur Verbesserung der Produktqualität folgte nach 20 bis 40 Zyklen ein „Final Extension"-Schritt von 10 bis 12 min bei 72 °C. Im Anschluß wurde der Ansatz auf 4 °C gekühlt und bei -20 °C gelagert.
2.3.6.1 Primer zur Amplifikation von cDNA-Fragmenten
Für die Amplifikation von cDNA Fragmenten von hMSH2 wurden die Primer MSH2-A, -D und MSH2-C wie zuvor von Liu et al. beschrieben verwendet [107,109]. Die Sequenz der Oligonukleotide MLH1-A bis -D für die Amplifikation von hMLH1 sind ebenfalls aus Publikationen übernommen worden [109]. Die Primer binden in der Reihenfolge A bis D in 5’-3’-Richtung in der Sequenz der Gene, wobei ihre Lage so gewählt ist, daß die entstehenden Amplifikate überlappen.
Primer | Sequenz |
|
|
|
|
MSH2-A
MSH2-B |
CAT GGC GGT GCA GCC GAA GG
CCT TGT AAA ACC TTC ATT TGA TCC T |
r |
|
|
|
MSH2-C
MSH2-D |
GAT TGT TAC CGA CTC TAT CAG
CCC AGT AAT GGA ATG AAG GTA ATA TTG ATA AGC |
r |
|
|
|
MLH1-A
MLH1-B |
CAT CTA GAC GTT TCC TTG GC
CAT CAA GCT TCT GTT CCC G |
r |
|
|
|
MLH1-C
MLH1-D |
GGG TGC AGC AGC ACA TCG
AAG TAT AAG TCT TAA GTG CTA CC |
r |
|
|
|
Tab. 2.2: Primer für die Amplifikation
von cDNA-Fragmenten. Die Sequenz ist in 5’-3’-Richtung angegeben. v: vorwärts
Primer, r: rückwärts Primer, die Größe des entstehenden
Amplifikats ist in Basenpaaren (bp) angegeben. Unter Codons sind die Tripletts
der kodierenden Sequenz des Fragments angegeben. Name: Bezeichnung des
bei Kombination der Primer entstehenden PCR-Produkts
Zur Amplifikation von cDNA Bereichen von hMSH2, hMLH1, hPMS1 und hPMS2, die später in einem IVSP-Assay eingesetzt werden sollten, sind ebenfalls zuvor beschriebene Primer verwendet worden [116,148]. Für APC wurde eigens entwickelte Primer verwendet, wobei die Amplifikation des Fragments sowohl mit cDNA als auch mit DNA möglich war. Der modifizierte Aufbau der IVSP-Vorwärtsprimer ist in Abbildung 2.1 ersichtlich.
Abb. 2.1: Primeraufbau
für IVSP-Assay. Das Schema ist in 5’-3’-Richtung angegeben. Die Basensequenz
GGATCC entspricht der Schnittstelle von BamH I. Mittig ist die Kozak-Konsensussequenz
dargestellt, hervorgehoben ist das Basentriplett ATG, das in der folgenden
Translation als Initiationsstelle fungiert. Die bindende Sequenz entspricht
der genkodierenden Basenfolge, wobei diese in Abhängigkeit vom ATG
Triplett „in-frame" zur Primersequenz paßt.
Die in dem Schema als komplementäre Sequenz bezeichnete Basenfolge
wurde in Abhängigkeit von der Translationsinitiationsstelle so gewählt,
daß die später daraus folgende Aminosäurenabfolge „in-frame"
der Triplettzuordnung des physiologisch exprimierten Proteins entsprechend,
translatiert wird. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2.3 zusammengestellt.
Fragment | Primer | Sequenz | Codons |
|
|
MSH2-1
|
MSH2-IVT-1s
MSH2-IVT-1as |
GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GGA
GAC CAC CAT GGC GGT GCA GCC GA
|
r |
1-609 |
|
MSH2-2 | MSH2-IVT-2s
MSH2-IVT-2as |
GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GGA GAC
CAC CAT GGT TGG CTT GGA CCC TGG CAA AC
|
r |
503-935 |
|
MLH1-1 | MLH1-IVT-1s
MLH1-IVT-1as |
GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GGA GAC
CAC CAT GGC ATC TAG ACG TTT CCT TGG C
|
r |
1-394 |
|
MLH1-2
|
MLH1-IVT-1s
MLH1-IVT-1as |
GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GGA GAC
CAC CAT GGG GGT GCA GCA GCA CAT CG
|
r |
324-730 |
|
PMS1-1 | PMS1-IVT-1s
PMS1.IVT-1as |
GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GGA GAC
CAC CAT GGA ACA ATT GCC TGC GG
|
r |
1-500 |
|
PMS1-2 | PMS1-IVT-2s
PMS1-IVT-2as |
GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GGA GAC
CAC CAT GGA AGA TAT CTT AAA GTT AAT CCG
|
r |
270-755 |
|
PMS1-3 | PMS1-IVT-3s
PMS1-IVT-3as |
GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GGA GAC
CAC CAT GGC AGG TCT TGA AAA CTC TTC G
|
r |
484-933 |
|
PMS2-1 | PMS2-IVT-1s
PMS2-IVT-1as |
GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GGA GAC
CAC CAT GGA GCG AGC TGA GAG C
|
r |
1-472 |
|
PMS2-2 | PMS2-IVT-2s
PMS2-IVT-2as |
GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GGA GAC
CAC CAT GGT GTC CAT TTC CAG ACT GCG
|
r |
414-856 |
|
APC-L | APC-sense
APC4633L |
GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GGA GAC CAC CAT GGG ACA AAG CAG TAA AAC CGA ACAT
TGA TTC TTT AGG CTG CTC TGA |
r |
1203-1545,
Exon 15 |
|
Tab. 2.3: Primer für die Amplifikation
von IVSP-Fragmenten. Die Sequenz ist in 5’-3’ Richtung angegeben. Fragment:
Nomenklatur des entstehenden PCR-Produkts, v: vorwärts Primer, r:
rückwärts Primer, Codons: gibt die das PCR-Produkt überspannende
kodierende Sequenz an, bp: bezeichnet die Größe des entstehenden
Amplifikats in Basenpaaren.
2.3.6.2 Primer zur genomischen Amplifikation
Die Sequenz der Primer zur genomischen Amplifikation der Exons inklusive
der angrenzenden Intronbereiche für hMSH2 und hMLH1 ist aus zuvor
erschienenen Arbeiten übernommen worden [68,93,94]. Die Primerlage
ist so gewählt, daß jeweils 24 bis 135 bp an Intronsequenzen
in 5’- und 3’-Richtung vom Exon mit amplifiziert wird.
|
Primer | Sequenz |
|
|
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MSH2-1s
MSH2-1as |
TCG CGC ATT TTC TTC AAC C
GTC CCT CCC CAG CAC GC |
r |
|
|
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MSH2-2s
MSH2-2as |
GAA GTC CAG CTA ATA CAG TGC
CTT CAC ATT TTT ATT TTT CTA CTC |
r |
|
|
|
|
MSH2-3s
MSH2-3as |
GCT TAT AAA ATT TTA AAG TAT GTT
C
GCC TTT CCT AGG CCT GGA ATC TCC |
r |
|
|
|
|
MSH2-4s
MSH2-4as |
TTC ATT TTT GCT TTT CTT ATT CC
ATA TGA CAG AAA TAT CCT TC |
r |
|
|
|
|
MSH2-5s
MSH2-5as |
CCA GTG GTA TAG AAA TCT TCG
CCA ATC AAC ATT TTT AAC CC |
r |
|
|
|
|
MSH2-6s
MSH2-6as |
GTT TTC ACT AAT GAG CTT GCC
GTG GTA TAA TCA TGT GGG |
r |
|
|
|
|
MSH2-7s
MSH2-7as |
GAC TTA CGT GCT TAG TTG
GTA TAT ATT GTA TGA GTT GAA GG |
r |
|
|
|
|
MSH2-8s
MSH2-8as |
GAT TTG TAT TCT GTA AAA TGA GAT
C
GGC CTT TGC TTT TTA AAA ATA AC |
r |
|
|
|
|
MSH2-9s
MSH2-9as |
GTC TTT ACC CAT TAT TTA TAG G
GTA TAG ACA AAA GAA TTA TTC C |
r |
|
|
|
|
MSH2-10s
MSH2-10as |
GGT AGT AGG TAT TTA TGG AAT AC
CAT GTT AGA GCA TTT AGG G |
r |
|
|
|
|
MSH2-11s
MSH2-11as |
CAC ATT GCT TCT AGT ACA C
CCA GGT GAC ATT CAG AAC |
r |
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MSH2-12s
MSH2-12as |
ATT CAG TAT TCC TGT GTA C
CGT TAC CCC CAC AAA GC |
r |
|
|
|
|
MSH2-13s
MSH2-13as |
CGC GAT TAA TCA TCA GTG
GGA CAG AGA CAT ACA TTT CTA TC |
r |
|
|
|
|
MSH2-14s
MSH2-14as |
TAC CAC ATT TTA TGT GAT GG
GGG GTA GTA AGT TTC CC |
r |
|
|
|
|
MSH2-15s
MSH2-15as |
CTC TTC TCA TGC TGT CCC
ATA GAG AAG CTA AGT TAA AC |
r |
|
|
|
|
MSH2-16s
MSH2-16as |
TAA TTA CTC ATG GGA CAT TC
TAC CTT CAT TCC ATT ACT GG |
r |
|
|
Tab. 2.4: Primer für die Amplifikation
der hMSH2-Exons. Die Sequenz der Primer ist in 5’-3’- Richtung angegeben.
v: vorwärts Primer, r: rückwärts Primer, bp gibt die Größe
des entstehenden Amplifikats in Basenpaaren an. Unter Name ist die Nomenklatur
der entstehenden PCR-Produkte angegeben.
|
Primer | Sequenz |
|
|
|
|
MLH1-1s
MLH1-1as |
AGG CAC TGA GGT GAT TGG C
TCG TAG CCC TTA AGT GAG C |
r |
|
|
|
MLH1-2s
MLH1-2as |
AAT ATG TAC ATT AGA GTA GTT G
CAG AGA AAG GTC CTG ACT C |
r |
|
|
|
MLH1-3s
MLH1-3as |
AGA GAT TTG GAA AAT GAG TAA C
ACA ATG TCA TCA CAG GAG G |
r |
|
|
|
MLH1-4s
MLH1-4as |
AAC CTT TCC CTT TGG TGA GG
GAT TAC TCT GAG ACC TAG GC |
r |
|
|
|
MLH1-5s
MLH1-5as |
GAT TTT CTC TTT TCC CCT TGG G
CAA ACA AAG CTT CAA CAA TTT AC |
r |
|
|
|
MLH1-6s
MLH1-6as |
GGG TTT TAT TTT CAA GTA CTT CTA
TG
GCT CAG CAA CTG TTC AAT GTA TGA GC |
r |
|
|
|
MLH1-7s
MLH1-7as |
CTA GTG TGT GTT TTT GGC
CAT AAC CTT ATC TCC ACC |
r |
|
|
|
MLH1-8s
MLH1-8as |
CTC AGC CAT GAG ACA ATA AAT CC
GGT TCC CAA ATA ATG TGA TGG |
r |
|
|
|
MLH1-´9s
MLH1-9as |
CAA AAG CTT CAG AAT CTC
CTG TGG GTG TTT CCT GTG AGT GG |
r |
|
|
|
MLH1-10s
MLH1-10as |
CAT GAC TTT GTG TGA ATG TAC ACC
GAG GAG AGC CTG ATA GAA CAT CTG |
r |
|
|
|
MLH1-11s
MLH1-11as |
GGG CTT TTT CTC CCC CTC CC
AAA ATC TGG GCT CTC ACG |
r |
|
|
|
MLH1-12s
MLH1-12as |
AAT TAT ACC TCA TAC TAG C
GTT TTA TTA CAG AAT AAA GGA GG |
r |
|
|
|
MLH1-13s
MLH1-13as |
TGC AAC CCA CAA AAT TTG GC
CTT TCT CCA TTT CCA AAA CC |
r |
|
|
|
MLH1-14s
MLH1-14as |
TGG TGT CTC TAG TTC TGG
CAT TGT TGT AGT AGC TCT GC |
r |
|
|
|
MLH1-15s
MLH1-15as |
CCC ATT TGT CCC AAC TGG
CGG TCA GTT GAA ATG TCA G |
r |
|
|
|
MLH1-16s
MLH1-16as |
CAT TTG GAT GCT CCG TTA AAG C
CAC CCG GCT GGA AAT TTT ATT TG |
r |
|
|
|
MLH1-17s
MLH1-17as |
GGA AAG GCA CTG GAG AAA TGG G
CCC TCC AGC ACA CAT GCA TGT ACC G |
r |
|
|
|
MLH1-18s
MLH1-18as |
TAA GTA GTC TGT GAT CTC CG
ATG TAT GAG GTC CTG TCC |
r |
|
|
|
MLH1-19s
MLH1-19as |
GAC ACC AGT GTA TGT TGG
GAG AAA GAA GAA CAC ATC CC |
r |
|
|
Tab. 2.5: Primer für
die Amplifikation der hMLH1-Exons. Die Sequenz der Primer ist in 5’-3’-Richtung
angegeben. v: vorwärts Primer, r: rückwärts Primer, bp gibt
die Größe des entstehenden Amplifikats in Basenpaaren an. Unter
Name ist die Nomenklatur der entstehenden PCR-Produkte angegeben.
Zur Bestimmung des Mikrosatellitenstatus im Kolongewebe wurden zehn
verschiedene, über das gesamte Genom verteilte, repetitive Sequenzen
mit einer Größe von 80 bis 160 bp amplifiziert. Die Sequenz
der Primer ist auch hier von verschiedenen Publikationen übernommen
worden [26,42,108,206].
Mikrosatellit | Lokus | Sequenz |
|
|
|
BAT 25 | 4q12 | TCG CCT CCA AGA ATG TAA GT
TCT GCA TTT TAA CTA TGG CTC |
r |
|
|
BAT 26 | 2p | TGA CTA CTT TTG ACT TCA GCC
AAC CAT TCA ACA TTT TTA ACC C |
r |
|
|
BAT 40 | 1p13.1 | ATT AAC TTC CTA CAC CAC AAC
GTA GAG CAA GAC CAC CTT G |
r |
|
|
Mfd 26 | 18q | CAG AAA ATT CTC TCT GGC TA
CTC ATG TTC CTG GCA AGA AT |
r |
|
|
Mfd 27 | 5q | GAT CCA CTT TAA CCC AAA TAC
GGC ATC AAC TTG AAC AGC AT |
r |
|
|
Mfd 41 | 17q | CAG GTT CTG TCA TAG GAC TA
TTC TGG AAA CCT ACT CCT GA |
r |
|
|
Mfd 49 | 15q | GAT AAA TGC CAA ACA TGT TGT
TGC TCT CAG GAT TTC CTC CA |
r |
|
|
D2S123 | 2p16 | ACA TTG CTG GAA GTT CTG GC
CCT TTC TGA CTT GGA TAC CA |
r |
|
|
D3S1293 | 3p | ACT CAC AGA GCC TTC ACA
CAT GGA AAT AGA ACA GGG T |
r |
|
|
D18S58 | 18q22.3 | GCT CCC GGC TGG TTT T
GCA GGA AAT CGC AGG AAC TT |
r |
|
|
Tab. 2.6: Primer zur
Amplifikation von Mikrosatelliten aus genomischer DNA. Die Sequenz aller
Primer ist in 5‘-3‘-Richtung angegeben. Lokus: Chromosomale Lokalisation
v: Vorwärtsprimer, r: Rückwärtsprimer, bp: Größe
des entsehenden Amplifikats, Referenz: Publikation aus welcher die Sequenz
der Primer übernommen wurde.
2.3.6.3 PCR-Bedingungen für die Amplifikation von cDNA
Die Zyklusanzahl, die Dauer der einzelnen Schritte, die Annealing-Temperatur,
die Primermenge und das Enzym für die Amplifikation jedes Genbereichs
ist für jedes Fragment einzeln in Abhängigkeit von der Produktqualität
ermittelt worden. Alle cDNA Fragmente von hMSH2 und hMLH1 sind mit der
„Hot-start"-Methode amplifiziert worden. Die Zyklusanzahl betrug bei den
mit Taq-Polymerase amplifizierten Fragmenten MSH2-I, MSH2-II und MLH1-I
40. Wohingegen MLH1-II bei 35 Zyklen mit der rTth-Polymerase amplifiziert
wurde. Die restlichen Parameter sind aus folgender Zusammenstellung zu
entnehmen:
MSH2-I und | Denaturierung: | 1 min | MLH1-I: | Denaturierung: | 1 min |
MSH2-II: | Annealing: | 60 °C, 1 min | Annealing: | 50 °C, 1 min | |
Elongation: | 2 min 30 s | Elongation: | 2 min 30 s | ||
Primermenge: | 10 pmol | Primermenge: | 10 pmol | ||
MLH1-II: | Denaturierung: | 1 min | |||
Annealing und | |||||
Elongation: | 62 °C, 4 min | ||||
Primermenge: | 25 pmol |
Die Fragmente MSH2-1 und -2, MLH1-1 und -2 und PMS1-1, die später
im IVSP-Assay eingesetzt werden sollten wurden mit der rTth-Polymerase,
10 pmol Primer und 35 Zyklen amplifiziert. Denaturiert wurde bei einer
Temperatur von 93 °C für 5 min. Der Annealing-/ Elongationsschritt
dauerte 3 min bei 62 °C. Die IVSP-Fragmente PMS1-2 , -3 und PMS2-2
wurden ebenfalls mit der rTth-Polymerase, 10 pmol Primer und 35 Zyklen
amplifiziert. Einem Denaturierungsschritt bei 93 °C für 5 min,
folgte ein Annealing-/Elongationsschritt von 60 °C für 4 min.
Das IVSP-Fragment PMS2-1 mußte mittels einer „Semi-nested"-PCR
amplifiziert werden. Zunächst wurde der gesamte kodierende Bereich
von PMS2 mit der rTh-Polymerase und jeweils 10 pmol der Primer PMS2-IVT-1s
und PMS2-IVT-2as mit 35 Zyklen vervielfältigt. Der Annealing-/Elongationsschritt
dauerte 5 min bei 60 °C. Nach vollendeter Reaktion wurde der Reaktionsansatz
1:100 verdünnt. Hiervon wurde 1 µl in den zweiten Schritt der
PCR zur Amplifikation des PMS2-1 Fragments eingesetzt. Dieser wurde mit
der Taq-Polymerase in 20 Zyklen und „Hot-Start"-PCR durchgeführt.
Hierzu wurden 10 pmol der Primer PMS1-1s und PMS1-1as eingesetzt. Nach
einer Denaturierung bei 95 °C für 1 min folgte ein Annealingschritt
bei 52 °C für 1 min 30 s und ein Elongationsschritt bei 72 °C
für 2 min.
Das Fragment APC-L wurde mit der Taq-Polymerase und „Hot-Start"-PCR
mit 10 pmol Primer in 40 Zyklen vervielfältigt. Denaturiert wurde
bei 95 °C für 1 min. Der Annealingschritt wurde bei 52 °C
für 1 min und 30 s und der Elongationsschritt bei 72 °C ebenfalls
für 1 min und 30 s durchgeführt.
2.3.6.4 PCR-Bedingungen für die Amplifikation genomischer DNA
Alle Exons von hMSH2 und hMLH1 sind mit Taq-Polymerase bei 40 Zyklen
amplifiziert worden, wobei jeder der drei Zyklusschritte 30 Sekunden dauerte.
Die Amplifikationsbedingungen sind in Tabelle 2.7 zusammengestellt.
temperatur |
menge |
|
Fragment |
|
|
|
L-Ex 12 |
|
|
|
S-Ex 4, S-Ex 5, S-Ex
9, S-Ex 10, S-Ex 11, S-Ex 16, L-Ex 16,
L-Ex 11, L-Ex 18 |
|
S- Ex 8, S-Ex 14, S-Ex 15, L-Ex 13, L-Ex 14 | ||
|
|
L-Ex 5, L-Ex 7, L-Ex 15 | |
|
|
L-Ex 2, L-Ex 3, L-Ex 9 | |
|
|
|
S-Ex 7, S-Ex 12 |
|
|
S-Ex 6 | |
|
S-Ex 2, S-Ex 3 | ||
|
|
|
S-Ex 13 |
|
|
S-Ex 1, L-Ex 1, L-Ex
4, L-Ex 6, L-Ex 8, L-Ex 10, L-Ex 16,
L-Ex 17, L-Ex 19 |
Tab. 2.7: Amplifikationsbedingungen
der genomischen hMSH2 und hMLH1 PCR Produkte geordnet nach der Annealingtemperatur.
Primermengen sind in pmol angegeben, die Annealingtemperatur in Grad Celsius.
Die Nomenklatur der Fragmente entspricht Tabelle 2.4 und 2.5.
Die Mikrosatelliten wurden in 25 µl Ansätzen mit 35 Zyklen
und Amplitaq Gold-Polymerase amplifiziert. Die Dauer des Denaturationschritts
betrug ebenso wie der des Annealings- und Elongationsschritts 45 Sekunden.
In einem Ansatz wurden mindestens 100 ng DNA eingesetzt. Mit Ausnahme der
Mikrosatelliten BAT 25, 26 und Mfd 41, deren Annealingtemperatur 50 °C
betrug, wurden alle anderen PCR-Produkte bei einer Annealingtemperatur
von 55 °C vervielfältigt.
2.3.7 Reinigung von Nukleinsäuren
2.3.7.1 Phenolextraktion
Zur Entfernung von Proteinen aus RNA-oder DNA-Proben wurde eine Phenolextraktion
nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt [185]. Hierbei wird dasselbe
Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) der nukleinsäurehaltigen
Lösung zugesetzt, gemischt und danach bei 14000 rpm für 5 Minuten
zentrifugiert. Die obere, die Nukleinsäuren enthaltende Phase wurde
in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dann wurde
die Probe nochmals mit einem gleichen Volumen Chloroform versetzt. Nach
wiederholter Zentrifugation wurde die obere Phase zuletzt in ein neues
Reaktionsgefäß überführt.
2.3.7.2 Alkoholische Präzipitation
Der DNA-haltigen Lösung wurde Natriumacetat bis zum Erreichen einer
Endkonzentration von 0.3 M zugegeben. Zur Fällung wurde der DNA das
2.5-fache Volumen Ethanol abs. oder das gleiche Volumen Isopropanol zugesetzt.
Zu dem Ansatz wurde dann 1µl Glykogen-Lösung (20 mg/ml) gegeben.
Der Reaktionsansatz wurde daraufhin entweder bei -70 °C für eine
Stunde oder bei -20 °C über Nacht inkubiert und im Anschluß
bei 4 °C und 14000 rpm für 30 Minuten pelletiert. Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet durch zweimalige Zugabe von 0.5 bis 1 ml
70%-igem Ethanol, anschließendem Mischen und folgender Zentrifugation
bei 14000 rpm für 3 Minuten gewaschen. Das Pellet wurde luftgetrocknet
und in 10 bis 50 µl ddH2O oder TE-Puffer resuspendiert.
2.3.7.3 Reinigung von PCR-Produkten
Um eventuell störende Salze und Nukleotide vom PCR-Produkt zu trennen
wurde das PCR Produkt über einen Centriconâ
100 (Ausschlußgröße 100 kDa) Membranzylinder aufgereinigt.
Hierzu wurde das ölfreie PCR-Produkt auf die Membran gegeben und 2
ml ddH2O dazupipettiert. In einem starren System wurde der Zylinder bei
3500 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, wodurch die größeren
PCR-Produkte von den Oligonukleotiden und Salzen durch die Membran getrennt
werden. Die Flüssigkeit des Auffangzylinders wurde verworfen. Dann
wurde zweimal ddH2O zugegeben und zentrifugiert. Die PCR-Produkte wurden
daraufhin aus der Membran herausgelöst, indem das Membransystem um
180° gewendet und bei 4000 rpm zentrifugatiert wurde.
2.3.8 Hydrolyse von DNA mittels Restriktionsendonukleasen
PCR-Produkte oder Plasmid-DNA wurde in Reaktionsvolumina von 10 bis
30 µl mittels Restriktionsendonukleasen sequenzspezifisch gespalten.
Die Reaktion wurde bei einer für das Enzym optimalen Temperatur von
37 °C, 50 °C oder 65 °C durchgeführt. Dem Reaktionsanstz
wurde entsprechend einem vom Hersteller mitgelieferter Puffer zugesetzt.
Bei einigen Enzymen wurde 1/10 des Reaktionsvolumens BSA-Lösung zugegeben.
Je nach Enzym wurde für eine bis acht Stunden inkubiert. Die Reaktionsansätze,
die bei 50 °C und darüber inkubierten, wurden mit einem Tropfen
Mineralöl überschichtet. Sollte Plasmid-DNA hydrolysiert werden,
so wurden 3 µl, bezogen auf einen 10 µl Ansatz, der Plasmid-Suspension
eingesetzt. Bei PCR-Produkten ist sieben bis acht µl eingesetzt worden.
Der Restriktionsverdau wurde anschließend auf einem Agarosegel kontrolliert.
2.3.9 Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsäuren
DNA-Fragmente wurden, je nach zu erwartender Fragmentgröße,
in einem 0.8 bis 2.8%igem (w/v) Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt.
Die Agarose wurde in TAE-Puffer durch Erhitzen gelöst und dann 0.5
µg/ml Ethidiumbromid dazugegeben. Nach Abkühlung auf unter 55
°C wurde die Agarose in horizontale Gelformen gegossen. Wenn die Agarose
erstarrt war, wurde das Gel zwischen die Elektroden der Elektrophoresekammer
gelegt. Je nach aufzutennender Probe wurden 2 bis 30 µl mit 1/10
Ladepuffer versetzt und in die Taschen des Gels pipettiert. Um die Länge
von DNA-Fragmenten abzuschätzen, wurden DNA-Längenstandarts aufgetragen,
die entweder die Größen 220 bp bis 12 kb, 100 bp bis 2072 bp
oder 10 bp bis 200 bp durch verschiedene Banden wiederspiegeln. Die Auftrennung
der Proben erfolgte bei einer Spannung von 6 bis 8 V/cm Längskantenlänge
des Gels mit TAE-Puffer als Laufpuffer. Die Fragmente wurden unter UV-Licht
sichtbar gemacht und zur Dokumentation fotografiert.
2.3.10 Heteroduplexanalyse
Zur Mutationsdetektion in dsDNA-Proben basiert die Heteroduplexanalyse
auf der Ausbildung von Heteroduplices zwischen zwei DNA-Strängen nach
vorhergehender Denaturierung [87,145]. Die zu analysierenden PCR-Produkte
wurden zunächst mit Phenol/Chloroform extrahiert, dann mit Ethanol
präzipitiert und in einem Fünftel des Ausgangsvolumens resuspendiert.
Ein Aliquot des PCR-Produkts wurde in einem Restriktionsendonukleasenansatz
hydrolysiert, wovon dann 10 µl bei 100 °C im Wasserbad für
5 Minuten inkubiert wurden. Der Reaktionsansatz wurde zur besonders langsamen
Abkühlung auf RT in dem zuvor kochenden Wasserbad über Nacht
belassen. Bei der Re-assoziation entstehen bei Punktmutationen oder kleinen
Deletionen neben den zu erwarten-den Homoduplices auch Heteroduplices,
welche verschiedene Wanderungsverhalten bei elektrophoretischer Auftrennung
aufweisen [145]. Die nicht-denaturierenden Acrylamidgele wurden als 100
ml-Ansätze zwischen 400 mm x 200 mm große ethanolgereingte Glasplatten
mit Abstandhaltern einer Dicke von 1 mm kurz nach Zugabe von TEMED und
10%-iger APS-Lösung gegossen. Nachdem das Gel eine Stunde polymerisierte,
wurde der 10 µl De-/Renaturierungsansatz mit 2 µl Ladepuffer
versetzt und auf das vertikal eingespannte Gel aufgetragen. Mit 0.6x TBE-Laufpuffer
wurden die Proben für 20 Stunden bei konstant 500 V aufgetrennt. Im
Anschluß wurden die Banden durch eine Silberfärbung visualisiert.
2.3.11 IVSP-Assay
Durch den „In vitro synthetisierten Protein"-Test (IVSP) lassen sich
Nonsense-Mutationen in cDNA oder DNA durch verkürzte Proteinprodukte
nachweisen [176,182]. Die Proteinherstellung erfolgt durch eine gekoppelte
in vitro Transkription und Translation (TnTâ
Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega). Hierbei sind PCR-Produkte
eingesetzt worden, welche mit dem unter 2.3.6.1 beschriebenen Vorwärtsprimer
amplifiziert wurden [95]. Durch diese Modifikationen ist es möglich,
in der Folge die PCR-Produkte mit der T7-Polymerase zu transkribieren und
die RNA im Anschluß in einem Retikulozytenlysat zu translatieren.
Die hierbei entstehenden Proteine wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt.
Jedes Fragment wurde in zwei Ansätzen amplifiziert die anschließend
vereinigt wurden, so daß eine Gesamtmenge von 100 µl entstand.
Nachdem das Mineralöl vom PCR-Reaktionsansatz abgehoben wurde, ist
der Ansatz durch eine Phenolextraktion gereinigt worden. Das PCR-Produkt
ist daraufhin in 11 µl TE-Puffer resuspendiert worden. 1 µl
wurde in einem 1.5%-igem Agarosegel zur Kontrolle der PCR aufgetrennt.
In der anschließenden gekoppelten in vitro Transkription/Translation
wurde mindestens 1.8 µg PCR-Produkt eingesetzt, mit dem Ziel, später
detektierbare, ausreichende Proteinmengen zu synthetisieren. Folgender
Reaktionsansatz ist daraufhin für 90 Minuten bei 30 °C inkubiert
worden:
Hasen Retikulozytenlysat |
12.5 µl
|
Reaktionspuffer (Promega) |
1 µl
|
T7-RNA Polymerase |
0.5 µl
|
Aminosäuren (Met-) (1mM) |
0.5 µl
|
35S-Methionin (>1000 Ci/mmol) |
2 µl
|
RNAse Inhibitor (40 U/µl) |
0.5 µl
|
PCR-Produkt |
1.8 µg
|
H2O |
add 25 µl
|
5 µl des Reaktionsansatzes wurden daraufhin mit 15 µl Probenpuffer
versetzt und für fünf Minuten auf 100 °C erhitzt worden.
Die restliche Probe wurde bei -20 °C gelagert. Die denaturierten Proteine
sind radioaktiv auf ein 12.5%- oder 15%-iges SDS-Acrylamidgel aufgetragen
worden. Als Längenstandard ist ein „high range" Rainbow-Protein-Längenstandard
verwendet worden. Die Proben wurden bei einer Stromstärke von 10 mA
im Sammelgel und dann bei 20 mA im Trenngel aufgetrennt, bis die 14.3 kD-Bande
des Rainbow-Längenstandards den Unterrand des Gels erreicht hatte.
Das Gel wurde daraufhin auf ein Filterpapier gelegt und mit Klarsichtfolie
bedeckt und für 90 Minuten vakuumgetrocknet. Die Detektion der Proteine
erfolgte autoradiografisch, wobei das während der Translation in die
Polypeptidketten eingebaute, radioaktiv markierte Methionin nachgewiesen
wurde. Das getrocknete Gel wurde für 18 Stunden bis zwei Tage bei
-70 °C auf einem Röntgenfilm exponiert.
2.3.12 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese von Proteinen
Für die Auftrennung der im IVSP-Test gebildeten Proteine wurde
eine Polyacrylamid-Gel Elektrophoese (PAGE) in einem Minigel der Größe
100 x 70 x 0.75 mm durchgeführt. Nachdem 6 ml 12.5%- oder 15%-ige
Trenngellösung polymerisierte, wurden 2 ml der Sammelgellösung
auf das Trenngel gegeben. Nachdem auch dieses polymerisierte, wurde an
das Gel, ohne aufgetragene Proben, eine Stromstärke von 7 mA für
10 Minuten angelegt. Die zu untersuchenden Proben sind nach Zugabe von
Probenpuffer für 5 Minuten bei 100 °C denaturiert und vollständig
aufgetragen worden. Solange sich die Proben in dem Sammelgel befanden,
wurde eine Stromstärke von 10 mA angelegt. Im Trenngel wurde die Stromstärke
auf 20 mA erhöht. Nach der Elektrophorese ist das Gel auf ein Filterpapier
übertragen, mit Klarsichtfolie bedeckt in einem Vakuumgeltrockner
(-1 bar) bei 80 °C für 90 Minuten getrocknet worden.
2.3.13 SSCP-Analyse
Die „Single-Strand-Conformation-Polymorphism"-Analyse (SSCP) ist eine
Methode um Polymorphismen, Punktmutationen oder auch kleine Deletionen
in dsDNA kleinerer PCR-Fragmente zu detektieren [158]. Zur Denaturierung
der zu untersuchenden DNA-Fragmente wurden 2.5 bis 5 µl PCR-Produkt,
je nach Intensität der Bande im vorausgegangenen Agarosegel, mit 8
µl SSCP-Stop-Lösung versetzt. Diese verhindert durch das Formamid
in alkalischer Lösung eine Reassoziation der durch das folgende Erhitzen
entstehenden DNA-Einzelstränge. Der Reaktionsansatz wurde nach fünfminütige
Denaturierung bei 100 °C zügig auf Eis gestellt. Analysiert wurden
die Proben in einem 0.6x MDEâ -Acrylamid-Gel
bei nicht denaturierenden Bedingungen. Nach 90 Minuten war das 400 mm x
200 mm x 1 mm große Gel polymerisiert. Daraufhin wurden 10 µl
des eisgekühlten Probengemisches in die Geltaschen pipettiert. Mit
0.6x TBE-Puffer als Laufpuffer wurden konstant 4.8 Watt für 14 Stunden
angelegt. Die aufgetrennten Einzelstränge wurden daraufhin durch eine
Silberfärbung sichtbar gemacht.
2.3.14 Silberfärbung von Acrylamidgelen
Zur Detektion von elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Proben in Acrylamidgelen
wurden Reagentien von BioRad verwendet. Heteroduplex- und SSCP-Gele sind
mit „Silver Stain" gefärbt worden. Das Herstellerprotokoll ist mit
Ausnahme der Erhöhung der Anzahl der Waschschritte von drei auf fünf
streng eingehalten worden. Acrylamidgele der Mikrosatellitenanalysen wurden
nach Herstellerangaben mit „Silver Stain Plus" gefärbt. Alle Schritte
der Färbungen wurden auf einem horizontalen Schütteltisch in
einer Glasschale durchgeführt. Zuletzt wurde das Acrylamidgel feucht
in Plastikfolien eingeschweißt und lichtgeschützt aufbewahrt.
2.3.15 Klonierung von PCR-Produkten
2.3.15.1 Ligation von PCR-Produkten
Zum Klonieren von PCR-Produkten wurde das TA-Cloningâ
Kit (Invitrogen, NV Leek, NL) verwendet. Hierbei wird das PCR-Produkt in
einen pCR IIâ oder pCR 2.1â
linearisierten Plasmid eingebracht (Abb. 2.2). Die Ligation wird ermöglicht
durch von der Taq-Polymerase an die 3‘-Enden des PCR-Produkts zusätzlich
angehängte Adenosinreste und entsprechenden Thymidinresten an den
3‘-Enden des linearisierten Plasmids. Die Ligation wurde in einem Gesamtvolumen
von 10 µl in einem 0.5 ml Reaktionsgefäß mit folgender
Zusammensetzung durchgeführt:
PCR-Produkt | 3 µl |
10x Ligationspuffer | 1 µl |
pCRâ 2.1 Vektor (25 ng/µl) | 2 µl |
ddH2O | 3 µl |
T4-DNA-Ligase | 1 µl |
Unabhängig von der Konzentration wurde immer 3 µl PCR-Produkt
eingesetzt. Der Reaktionsansatz wurde bei 14 °C über Nacht inkubiert.
Abb. 2.2: pCRâ
II Vektorkarte. Oben detailliert dargestellt ist die an das zu ligierende
PCR-Produkt direkt angrenzende Sequenz des Plasmids. Erkennbar sind der
Sp6 und T7 Promoter und die das PCR-Produkt flankierenden Schnittstellen
von EcoRI. Die Sp6 Sequenz fehlt im pcRâ2.1
Vektor. Im Vektorring steht lac für die durch ein ligiertes PCR-Produkt
unterbrochene Sequenz der b -Galaktosidase für
eine Blau/Weiß Selektion. Ampicillin und Kanamycin symbolisiert die
Genbereiche für einsprechende Antibiotikaresistenzen. ColE1 ori bezeichnet
den regulierenden Bereich für die Plasmidreplikation.
2.3.15.2 Transformation kompetenter Bakterien
Bei allen in der Folge beschriebenen Arbreiten mit Bakterien wurde ausschließlich
mit sterilen Plastikwaren und autoklavierten Lösungen gearbeitet.
Häufig verwendete Gegenstände wurden zwischen jedem Arbeitsschritt
durch Eintauchen in Isopropanol und folgendem Erhitzen über einer
Flamme sterilisert. Als kompetente Bakterien wurden INVaF' One Shotâ
Escherichia coli (Invitrogene, NV Leek, NL) verwendet. Die in 50 µl
Aliquots bei -70 °C gelagerten Bakterien wurden auf Eis aufgetaut.
Zunächst wurde 2 µl 0.5 M b -Mercaptoethanol
zugegeben und vorsichtig mit den Bakterien vermischt. 2 µl Ligationsansatz
wurde dazupipettiert und durch leichtes hin- und herbewegen mit der Bakteriensuspension
vermischt. Nachdem der Reaktionsansatz für 30 Minuten auf Eis inkubiert
worden war, wurde die Bakteriensuspension für 30 Sekunden auf 42 °C
im Wasserbad erhitzt und für 2 Minuten zurück auf Eis gestellt.
Es wurde dann 250 µl SOC-Medium dazugegeben und der Ansatz für
eine Stunde bei 200 rpm im Schüttler bei 37 °C inkubiert. Im Anschluß
wurden 50 µl bzw. 200 µl des Ansatzes auf jeweils eine LB-Agarplatte
mit einer Antibiotikakonzentration von 50 µg/ml Kanamycin oder Ampicillin
ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Bei einer Blau/Weiß-Selektion
wurde 40 µl einer 40 mg/ml X-Gal enthaltenden Lösung auf die
Agarplatten ausgestrichen. Die Platten wurden mindestens eine Stunde bei
37 °C gelagert, um das X-Gal einziehen zu lassen, bevor die Bakterien
ausplattiert wurden.
2.3.15.3 Blau/Weiß-Selektion von Bakterienkolonien
Zur Unterscheidung der Bakterienkolonien, die mit einem das Insert enthaltenden
Plasmid transformiert wurden, von den Kolonien, bei denen die Ligation
oder die Transformation nicht erfolgreich war, diente die Blau/Weiß-Selektion.
Diese basiert auf der Tatsache, daß b
-Galaktosidase X-Gal zu einem blauen Farbstoff umsetzt. Wie in Abbildung
2.2 zu erkennen ist, wird die kodierende Sequenz für die Galaktosidase
im pCRâ II oder 2.1 Vektor durch ein ligiertes
PCR-Produkt unterbrochen. Dies hat zur Folge, daß Bakterienkolonien
welche auf X-Gal enthaltenden Agarplatten wachsen, weiß erscheinen,
wenn sie ein Insert-haltiges Plasmid besitzen. Entsprechend blau erscheinen
Kolonien, welche ein Insert-freies Plasmid tragen.
2.3.15.4 „Colony-Screening"
Als Sonde für das „Colony-Screening" wurde folgendes Oligonukleoid radioaktiv markiert:
5‘-CAT ATC CAA TGC AAA CTA CT-3‘
Diese innerhalb von Exon 9 des hMSH2 Gens bindende Sonde wurde an der
5‘-OH-Gruppe mit g -32P-ATP phosphoryliert.
Der Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:
Oligonukleotid (3.7 ng/µl) |
2.7 µl
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10x Kinase-Puffer |
1.5 µl
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T4-Polynukleotid-Kinase (10 U/µl) |
1.5 µl
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g -32P-ATP (10 µCi/µl) |
7.5 µl
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ddH2O |
1.8 µl
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Der Reaktionsansatz mit einem Gesamtvolumen von 15 µl wurde für
eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Kinase wurde danach bei 65 °C
für 5 Minuten inaktiviert. Zum Abtrennen nicht eingebauter Radioaktivität
wurde das Oligonukleotid mit einer NAPâ
-5 Säule gereinigt. Diese wurde zunächst mit TE-Puffer äquilibriert.
Zu den 15 µl des Reaktionsansatzes wurden 485 µl TE-Puffer
gegeben. Das Gesamtvolumen von 500 µl wurde dann auf die Säule
gegeben, wodurch Salze und nicht eingebaute Nukleotide entfernt wurden.
Das radioaktiv markierte Oligonukleotid wurde zuletzt mit 1 ml TE-Puffer
eluiert.
Für das „Colony-Screening" wurde ein Nitrozellulose-Filter luftblasenfrei
auf eine mit Bakterienkolonien bewachsenen LB-Agarplatte gelegt. Um eine
spätere Zuordnung der autoradiografischen Signale auf dem Röntgenfilm
mit den Bakterienkolonien zu ermöglichen, wurden je Platte drei Markierungspunkte
mit Tinte im Agar und auf dem Filter gesetzt. Der Filter wurde abgezogen
und daraufhin nacheinander in folgende drei Lösungen gelegt, wobei
er zwischen jedem Schritt luftgetrocknet wurde.
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In Lösung 3 wurde der Filter zweimal gelegt. Die Nitrozellulosemembran
wurde dann in Filterpapier eingepackt und im Vakuumofen bei 80 °C und
-1 bar inkubiert. Die Nitrozellulose wurde daraufhin bei 42 °C mit
10 ml Rapid-Hyb-Buffer im Hybridisationsofen prähybridisiert. Eine
entsprechende Menge des o.g. radioaktiv markierten Oligonukleotids wurde
mit weiteren 10 ml Rapid-Hyb-Buffer versetzt, so daß eine Endaktivität
von 1-3 * 106 cpm/ml erreicht wurde. Die Nitrozellulosemembranen
wurden bei 42 °C für 2 Stunden in der Hybridisierlösung mit
der Sonde inkubiert. Die Temperatur ergab sich aus der Formel unter 2.3.6,
wobei sich die Hybridisierungs-temperatur aus TM -10 °C
errechnet. In der Folge wurden die Membranen bei 50 °C gewaschen, was
ungefähr der Temperatur TM entspricht. Hierzu wurden die
Nitrozellulose-membranen dreimal mit 2x SSC, 0.1% (w/v) SDS-Lösung
für 5 Minuten gewaschen. Anschließend wurden die Membranen zweimal
mit 1x SSC, 0.1% (w/v) SDS-Lösung für 15 Minuten inkubiert. Die
Membranen wurden dann feucht eingeschweißt und über Nacht auf
einem Röntgenfilm exponiert. Durch die vorherigen Markierungen war
nach der Filmentwicklung eine Zuordnung der autoradiografischen Signale
zu Bakterienkolonien möglich. Mit den positiven Kolonien wurde wie
unter 2.3.15.5 beschrieben weiterverfahren.
2.3.15.5 Zwischenkultur von Bakterienklonen
Je nach Auswahlkriterium Blau/Weiß-Selektion oder „Colony-Screening"
wurde mit einem sterilen Zahnstocher entsprechend positive Bakterienkolonien
von der LB-Agarplatte in 2 ml LB-Medium, das Kanamycin oder Ampicillin
in einer Konzentration von 50 µg/ml enthält, überführt.
Die Zellsuspension wurde daraufhin über Nacht bei 37 °C in einem
Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die Bakteriensuspension
in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt, bei 14000 rpm
für 5 Minuten zentrifugiert, und der Überstand abgenommen. Das
Bakterienpellet wurde entweder sofort weiter bearbeitet oder bei -20 °C
gelagert.
2.3.16 Isolation von Plasmid-DNA
Mit Hilfe der Alkalischen Lyse nach Birnboim und Doly (1997) wurde Plasmid-DNA
isoliert [12]. Hierbei wird Plasmid-DNA, von linearisierter DNA und Proteinen
bzw. Zelldetritus durch folgende drei Lösungen getrennt.
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Das Bakterienpellet aus der Zwischenkultur wurde in 100 µl eisgekühlter
Lösung 1 resuspendiert und 5 Minuten bei offenem Deckel bei RT inkubiert.
Daraufhin wurde 200 µl Lösung 2 dazupipettiert. Die Lösungen
wurden vorsichtig durch antippen gemischt. Die Zellen wurden dann mit 150
µl Lösung 3 endgültig lysiert. Der Reaktionsansatz wurde
dann für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde bei
14000 rpm für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, wodurch die Plasmid-DNA
von der linarisierten DNA und den denaturierten Proteinen getrennt wird.
Die wäßrige Phase wurde in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß
überführt, und eine Phenolextraktion durchgeführt. Die obere
Phase wurde abgehoben und mit demselben Volumen Isopropanol versetzt. Der
Ansatz wurde 10 Minuten bei RT inkubiert und daraufhin bei 14000 rpm für
5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet
dann in 100 µl TE-Puffer resuspendiert. Zur weiteren Reinigung der
DNA wurde eine alkoholische Fällung mit Ethanol abs. unter Zugabe
von 1 µl RNAse, DNAse-frei durchgeführt. Die Fällung erfolgte
bei -20 °C über Nacht. Es folgte eine Zentrifugation bei 14000
rpm für 15 Minuten bei 4 °C. Anschließend wurde das Pellet
in 20 bis 50 µl ddH2O resuspendiert. Zur Überprüfung, ob
das vermutete Insert tatsächlich im Plasmid vorliegt, wurde ein Aliquot
von 3 µl in einen 10 µl Ansatz eines Restriktionsverdaus mit
EcoRI eingesetzt (Schnittstellen von EcoRI: siehe Abb. 2.2). Der Restriktionsverdauansatz
wurde in einem 2%-igem Agarosegel aufgetrennt und das Insert als Fragment
einer bestimmten Größe nachgewiesen.
2.3.17 DNA-Sequenzierung
Die DNA wurde nach der Dideoxy-Methode sequenziert [187]. Hierbei kommt
es durch den Einbau von 2‘-3‘-Dideoxy- nukleotiden (ddNTPs) anstelle normaler
dNTPs während der Sequenzierungsreaktion zu statistisch zufälligen
Kettenabbrüchen. Diese unterschiedlich langen DNA-Fragmente können
dann elektrophoretisch aufgetrennt werden. Die Sequenzierungs- reaktionen
von PCR-Produkten und Plasmid-DNA wurden mit DyeDeoxy-Terminatoren durchgeführt.
Diese mit vier verschiedenen Fluoreszensfarbstoffen markierten ddNTPs wurden
mit Hilfe der Amplitaq DNA-Polymerase, FS durch zyklische Sequenzierung
in die Amplifikate eingefügt. Mit Ausnahme des Primers sind alle notwendigen
oben genannten Komponenten dieser Sequenzierungsreaktion im ABI PRISMâ
„Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Perkin Elmer, Langen)
enthalten:
Es wurde 3 bis 4 µl Plasmid-DNA oder 3 bis 10 µl, zuvor
durch Centriconâ 100 gereinigtes, PCR-Produkt
in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt. Zusammen mit 10 pmol Primer und
8 µl Terminator „Ready Reaction Mix" wurde der Reaktionsansatz mit
ddH2O auf 20 µl Gesamtvolumen aufgefüllt. Als Primer
wurde bei zuvor klonierten PCR-Produkten T7- oder Sp6-Oligonukleotide verwendet.
Wenn direkt vom PCR-Produkt sequenziert wurde, so sind nach vorheriger
Centriconâ 100 Aufreinigung die unter
2.3.6.1 aufgeführten Oligonukleotide verwendet worden. Mit einem Tropfen
Mineralöl überschichtet wurde der Reaktionsansatz im Thermocycler
mit folgenden Bedingungen linear amplifiziert:
Denaturierung: 96 °C, 30 s
Annealing: 50 °C, 15 s
Elongation: 60 °C, 4 min
Nach 25 Zyklen wurde der Reaktionsansatz bei 4 °C zwischengelagert.
Im Anschluß wurde der Ansatz mit Ethanol abs. versetzt und für
20 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wurde das Pellet einmal mit 70%-igem
Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde daraufhin luftgetrocknet. Die weitere
Analyse erfolgte mit einem DNA Sequenzautomaten (373A oder 377 von Applied
Biosystems/ABI PRISM) im Servicelabor des Instituts für Zellbiochemie
und klinische Neurobiologie des Universitäts- krankenhauses Hamburg-Eppendorf.
Die Sequenzierdaten wurden manuell und mit Hilfe des Programms MacMolly,
Version 3.5 ausgewertet.
2.3.18 RFLP-Analyse
Die in dieser Arbeit durchgeführte Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus-Analyse (RFLP) wurde modifiziert auf Basis eines bei Exon 11 von hMSH2 liegenden PCR-Produkts durchgeführt. Diese Methode basiert auf einer enzymatischen Amplifizierung des zu untersuchenden DNA Fragments mit teilweise fehlgepaarten Primern. Hieraus folgt eine artifizielle Schnittstelle einer Restriktionsendonuklease, welche einen Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus entstehen läßt, der die zu untersuchende Punktmutation anzeigt [98,99]. Diese RFLP-Analyse sollte zum gezielten Familienscreening für eine zuvor identifizierte Glu580à Stop Punktmutation verwendet werden. Es wurde Exon 11 von hMSH2 mit folgenden Primern amplifiziert:
Vorwärtsprimer: „RFLP-MSH2-11s"
TCT ATT AAG TTT ACC TGA AGA GAT ATG AAC AAT
TT
Beide Oligonukleotide sind in 5’-3’- Richtung angegeben. Unterstrichen sind die Basenfehlpaarungen zwischen dem Primer und der Originalsequenz, fettgedruckt ist die Erkennungsregion des Enzyms Xmn I. Für die PCR wurde die Amplitaq Gold mit 15 pmol je Primer und 40 ng DNA verwendet. Die zyklische Amplifizierung wurde bei 40 Zyklen unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Denaturierung: 95 °C, 1min
Annealing: 50 °C, 1 min, 30 s
Elongation: 72 °C, 1 min, 30 s
Das so entstandene, 184 bp große, PCR-Produkt wurde dann in einem
20 µl-Ansatz bei 37 °C für zwei Stunden hydrolysiert. Im
o.g. Vorwärtsprimer ist eine Schnittstelle für Xmn I als Verdaukontrolle
vorhanden, so daß bei erfolgreichem Restriktionsverdau ein 20 bp
großes Fragment vom PCR-Produkt abgetrennt wird (Abb. 2.3). Die Lage
der Schnittstelle von Xmn I im o.g. Rückwärtsprimer wurde so
gewählt, daß die letzte Base der Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms
(Cytosin, bzw. Guanin) die erste, an den Primer angrenzende, Base der kodierenden
Sequenz ist. Diese Nukleinsäure an Position 1738 bp der kodierenden
Sequenz von hMSH2 ist, wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, bei einigen
Familienmitgliedern mutiert. Liegt die Wildtypsequenz vor (rückwärts-komplementär
Cytosin) so trennt das Restriktionsenzym, zusätzlich zum 20 bp Fragment
des Vorwärtsprimers, ein 31 bp großes Fragment ab, so daß
nach dem Restriktionsverdau bei der Wildtypsequenz ein Fragment der Länge
133 bp entsteht.
Abb. 2.3: Schematische
Darstellung der amplifizierten Genregion des Exon/Intron-Bereichs von hMSH2.
Xmn I bezeichnet die Schnittstellen des Enzyms, die 20, bzw. 31 bp von
den Rändern des PCR-Produkts entfernt sind. Die 5‘- gelegene Schnittstelle
fungiert als Verdaukontrolle, wohingegen die 3‘- gelegene Xmn I Erkennungssequenz
eine Base nach der zu untersuchenden Mutation bei 1738 bp beginnt. Diese
Schnittstelle ist ist vorhanden bei der Wildtypsequenz, wohingegen sie
wegfällt im Falle einer vorhandenen Mutation.
Beim Vorliegen der Glu580à Stop
Mutation an der Stelle 1738 bp findet sich keine Cytosin, sondern eine
Adenin Base (rückwärts-komplementär), so daß die zweite
Schnittstelle von Xmn I wegfällt. Im heterozygoten Fall wäre
somit ein Fragment der Länge 133 bp (Wildtyp) und ein weiteres der
Länge 164 bp (Mutante) zu finden (Abb. 2.3 und Abb 3.12, Seite 69).
In einem 2.8%-igem Agarosegel sind die Proben nach dem Restriktionsverdau
aufgetrennt worden.
2.3.19 Bestimmung des Mikrosatellitenstatus
Zur Untersuchung von Tumorgewebe auf Mikrosatelliteninstabilität
wurden die PCR-Produkte der repetitiven Sequenz des Tumor- mit der des
Normalgewebes verglichen. Hierzu sind 4 µl der PCR-Produkte mit 8
µl SSCP-Stop-Lösung versetzt und bei 98 °C im Wasserbad
für fünf Minuten denaturiert und sofort auf Eis überführt
worden. Die Proben wurden zügig auf ein 400 mm x 200 mm x 0.75 mm
großes, denaturierendes, 6.7 %-iges Acrylamidgel, das 50% Harnstoff
enthält, aufgetragen. An das unbeladene Gel wurde mindestens 30 Minuten
vor dem Auftragen der Proben eine Spannung von 1500 V angelegt, um eine
gleichmäßige Erwärmung des Gels sicherzustellen. Die Proben
wurden daraufhin bei konstanten 1500 V für ungefähr zwei Stunden
aufgetrennt. Zur Detektion der Banden wurde das Gel mit Silver Stain Plus
gefärbt (BioRad).
2.4 Probenmaterial
Von folgenden Familienmitgliedern standen Blutproben zur Verfügung,
aus welchen DNA isoliert wurde: II.2, II.3, II.4, II.5, III.2, III.3, III.4,
III.5, III.7, III.8, III.8. Bei Indexpatientin II.5 ist zusätzlich
RNA präpariert worden. Zusätzlich standen in Paraffin gebettete
Tumorgewebeproben von Kolonkarzinomen der Probanden II.5 und III.8 zur
Verfügung, von zuletzt genannter Person zusätzlich ein Gewebeblock
eines in situ Karzinoms der Cervix Uteri.
Als DNA Negativ- oder Normalkontrollen wurden insbesamt 17 Blutproben
von Personen verwendet, bei denen kein Verdacht auf einen bestehenden oder
durchgemachten malignen Prozeß besteht. Diese wurden mit dem Kürzel
NC („normal control") versehen und durchnummeriert. Aus diesen 17 Blutproben
wurde in neun Fällen RNA gewonnen und als Negativ- kontrolle eingesetzt,
deren cDNA mit dem Kürzel N (normal) versehen wurden. Ergänzend
wurden zwei cDNAs aus Normalgewebe des Kolons (N66 und N69) bei der Untersuchung
der hMLH1-Spleißvarianten verwendet.
Als Negativkontrolle bei der Untersuchung der Mikrosatelliten ist DNA
aus Normalgewebe eines Kolons (NT11) verwendet worden. Als methodische
Positivkontrollen wurde die DNA der Prostatakarzinomzellinie DU 145 mit
einer definierten Mutation in hMLH1 für die SSCP und T33, eine cDNA
von Tumorgewebe eines sporadischen Kolonkarzinoms, mit definierter Mutation
im APC Gen, bei dem IVSP-Assay verwendet [20].