2 Material und Methoden
 

2.1 Materialien
 

2.1.1 Chemikalien

1 kb DNA-Längenstandard
Gibco BRL (Eggenstein)
10 bp DNA-Längenstandard
Gibco BRL (Eggenstein)
100 bp DNA-Längenstandard
Gibco BRL (Eggenstein)
a S35-Methionin
ICN (Meckenheim)
Acrylamid-Bisacrylamid 19:1 (w/v)
Serva (Heidelberg)
Agarose
Biozym (Hess. Oldendorf)
Ammoniumpersulfat
Bio Rad (München)
Ampicillin
Sigma (Deisenhofen)
Bacto-Agar
Difco (Detroit, USA)
Bacto-Tryptone
Difco (Detroit, USA)
Bacto-Yeast Extract
Difco (Detroit, USA)
b -Mercaptoethanol
Serva (Heidelberg)
Bromphenolblau
Merck (Darmstadt)
BSA
NEB (Schwalbach)
dNTPs
Phamacia (Freiburg)
EDTA-Na2
Merck (Darmstadt)
Ethidiumbromid
Merck (Darmstadt)
Ficoll-Paque
Phamacia (Freiburg)
g P32-ATP
NEN (Brüssel, Belgien)
Glycerol
Merck (Darmstadt)
Glykogen
Boehringer (Mannheim)
Guanidiniumisothiocyanat (GIT)
Fluka (Neu-Ulm)
Kanamycin
ICN (Meckenheim)
MDEâ -Acrylamidlösung (2x)
FMC (Rockland, USA)
Mineralöl
Sigma (Deisenhofen)
Nonidetâ P 40 (NP 40)
Fluka (Neu-Ulm)
Phenol (Trisâ -gepuffert, pH 8,0)
USB (Braunschweig)
Rainbow-Protein-Längenstandard
Amersham (Braunschweig)
Random Hexamere
USB (Braunschweig)
Rapid-hyb-buffer
Amersham (Braunschweig)
Silberfärbung (Silver Stain und Silver Stain Plus)
Bio Rad (München)
SDS 
Sigma (Deisenhofen)
TEMED
Bio Rad (München)
Trisâ (ultrapure)
ICN (Meckenheim)
Trizol
Gibco BRL (Eggenstein)
X-Gal
Biomol (Hamburg)
Xylencyanol FF
Serva (Heidelberg)
 

2.1.2 Enzyme

Amplitaq DNA-Polymerase, FS
Perkin Elmer (Langen)
Amplitaq Gold DNA-Polymerase
Perkin Elmer (Langen)
Proteinase K
Sigma (Deisenhofen)
Restriktionsendonukleasen
NEB (Schwalbach) und 
Gibco BRL (Eggenstein)
RNAse Inhibitor
Boehringer (Mannheim)
RNAse, DNAse-frei
Boehringer (Mannheim)
rTth-DNA Polymerase
Perkin Elmer (Langen)
Superscript II
Gibco BRL (Eggenstein)
T4-DNA-Ligase
Invitrogen (NV Leek, NL)
T4-Polynukleotid Kinase
NEB (Schwalbach) 
T7-RNA-Polymerase
Promega (Madison, USA)
Taq DNA-Polymerase
Gibco BRL (Eggenstein)
 

2.1.3 Allgemeine Labormaterialien

0,5-2 ml Reaktionsgefäße
Eppendorf (Hamburg)
15-50 ml Reaktionsgefäße
Eppendorf (Hamburg)
centriconâ 100
Amicon (Witten)
Filterpapier 3MM
Schleicher und Schüll (Dassel)
„Glasmax spin cartridge" system
Gibco BRL (Eggenstein)
NAPâ -5 Säulen
Pharmacia (Brüssel)
NAPâ -10 Säulen
Pharmacia (Brüssel)
Nitrozelluloserundfilter BA 85
Schleicher und Schüll (Dassel)
Plastikartikel (Pipettenspitzen, Pipetten, Petrischalen)
Eppendorf (Hamburg), Biozym (Hess. Oldendorf), Falcon (Heidelberg), Greiner (Frickenhausen)
Röntgenfilm (Hyperfilm MP)
Amersham (Braunschweig)
 

2.1.4 Geräte

400 mm Acrylamidgel-Aparatur
Cti (Idstein)
Agarosegelkammern
Hoefer (San Francisco, USA)
Autoklav
Tecnomara (Fernwald)
Fotoapparatur und Filme für Agarosegele
Polaroid (Cambridge, USA)
Gel-Trockner
Hoefer (San Francisco, USA)
Gene Assembler Plus
Pharmacia (Freiburg)
Heizblock
Techne (Cambridge, UK)
Hybridisierungsofen
GFL (Burgwedel)
Inkubationsofen
Heraeus (Hanau)
Inkubationsschüttler
CLF (Emersacker)
Mikroskop 
Zeiss (Oberkochen)
pH-Meter
Beckmann (München)
Pipetten (10, 100 und 1000 µl)
Eppendorf (Hamburg)
Proteingelkammern
Biometra (Göttingen)
Röntgenfilmkassette
Amersham (Braunschweig)
Spannungsgeräte
Pharmacia (Freiburg) 
SpeedVac (Vakuumzentrifuge)
Savant (Hicksville, USA)
Standzentrifugen
Hermle (Gosheim) und Sorvall, Du Pont (Bad Homburg)
Szintillationszähler (Tri-Carb)
Canberra Packard (Frankfurt)
Thermocycler (Minicycler)
Biozym (Hess. Oldendorf)
Tischzentrifugen 
Heraeus (Hanau) und Eppendorf (Hamburg)
UV-Spektrophotometer
Shimadzu (Duisburg)
Vakuumofen
Elektro-Wärme (Aachen)
Vortexer
Braun (Melsungen)
Waagen
Mettler (Gießen)
 
 

2.2 Lösungen und Kulturmedien
 

Ammoniumpersulfat
10% (w/v) Ammoniumpersulfat
Denaturierendes Polyacrylamidgel
6.7% (w/v) Acylamid/Bis 1:19
8.3 M Harnstoff
45 mM Trisâ -Borat
0.5 mM EDTA
0.04% (v/v) TEMED
0.04% (w/v) Ammoniumpersulfat
Heteroduplexgel
50% (v/v) MDE-Solution (2x)
54 mM Trisâ -Borat
0.6 mM EDTA
0.04% (v/v) TEMED 
0.04% (w/v) Ammoniumpersulfat
Ladepuffer für Agarosegelelektrophoresen
0.04% (w/v) Bromphenolblau
0.04% (w/v) Xylencyanol FF
2.5% (w/v) Ficoll, in TAE-Puffer
Ladepuffer für Heteroduplexgele
0.04% (w/v) Orange G
0.04% (w/v) Bromphenolblau
0.04% (w/v) Xylencyanol FF
50% (w/v) Sucrose
LB-Agarplatten
15 g/l Bacto-Agar
10 g/l Bacto-Tryptone
5 g/l Bacto-Yeast Extract
10 g/l NaCl, pH 7.0
LB-Medium
10 g/l Bacto-Tryptone
5 g/l Bacto-Yeast Extract
10 g/l NaCl, pH 7.0
Phenol-Chloroform (für DNA Extraktion)
50% (v/v) Phenol 
48% (v/v) Chloroform
2% (v/v) Isoamylalkohol 
Proteinase K Puffer
50 mM Trisâ -HCl
10 mM NaCl
0,1% (v/v)Tritonâ X-100
Sammelgel
5% (w/v) Acrylamid
0.1% (w/v) Bisacrylamid
125 mM Trisâ -HCl (pH 6.8)
0.1% (w/v) SDS
0.05% (w/v) Ammoniumpersulfat
0.01% (v/v) TEMED
SDS Probenpuffer für Proteingele
20% (v/v) Glycerol
2% (w/v) SDS
0.25% (w/v) Bromphenolblau
50 mM Trisâ -HCl (pH 6.8)
5% (v/v) b -Mercaptoethanol
SDS-Laufpuffer für Proteingele
19.2 mM Glycin
2.5 mM Trisâ -HCl
0.1% (w/v) SDS
SOC-Medium
2% (w/v) Tryptone
0.5% (w/v) Yeast-Extrakt
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
20 mM Glukose
SSC-Lösung (1x)
150 mM NaCl
15 mM Na3Citrat, pH 7.4
SSCP-Gel
30% (v/v) MDE-Solution (2x)
54 mM Trisâ -Borat
0.6 mM EDTA
0.04% (v/v) TEMED
0.04% (w/v) Ammoniumpersulfat
Stop-Lösung für SSCP-Gele 
95% (v/v) Formamid
20 mM EDTA
0.25% (w/v) Bromphenolblau
0.25% (w/v) Xylencyanolblau
TBE-Puffer
90 mM Trisâ -Borat
1 mM EDTA, pH 8.0
TE-Puffer
10 mM Trisâ -HCl
1 mM EDTA, pH 8.0
Trenngel
12.5%-15% (w/v) Acrylamid
0.1% (w/v) Bisacrylamid
375 mM Trisâ -HCl (pH 8.8)
0.1% (w/v) SDS
0.05% (w/v) Ammoniumpersulfat
0.01% (v/v) TEMED
     
     

    2.3 Arbeitsmethoden
     

    2.3.1 Isolierung von Nukleinsäuren

    2.3.1.1 RNA-Präparation aus Lymphozyten

    Über 8 ml Ficoll wurde vorsichtig 4 ml Vollblut geschichtet. Für 30 min wurde dann bei 1500 rpm (RT) im „Swing-out"-Rotor zentrifugiert, danach die obere Serumschicht abgehoben und verworfen. Der trübe Lymphoztenring (1,5 bis 2 ml) wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei 6000 rpm (RT) für 5 min zentrifugiert. Wenn der Überstand daraufhin noch trüb war, wurde nochmals bei 8000 rpm für 5 min zentrifugiert. Nachdem der Überstand verworfen, und 500 µl Trizol zum Lysieren der Zellen dazugegeben wurde, konnte die Suspension durchgemischt werden. Nach Zusetzen von 100 µl Chloroform wurde der Reaktionsansatz in der Folge für drei Minuten bei RT inkubiert, und für 15 Minuten bei 12000 g und 4 °C zentrifugiert. Daraufhin bilden sich drei Phasen. Die obere, ca. 400 µl umfassende, RNA-haltige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und dasselbe Volumen Isopropanol zugesetzt. Das Gemisch wurde dann bei RT für 10 min inkubiert. Daraufhin wurde die RNA bei 4 °C und 12000 g für 10 min pelletiert, um dann das Pellet zweimal mit 1 ml 70%-igem Ethanol zu waschen (7500 g, 4 °C, 5 min). Die RNA wurde dann luftgetrocknet und in 10 bis 50 µl ddH2O resuspendiert.
     

    2.3.1.2 DNA-Präparation aus Vollblut

    Die DNA-Isolierung aus Vollblut erfolgte modifiziert nach Nollau et al. (1996) mit Hilfe von Glasmembranen [17,152,218]. In ein 1.5 ml Reaktionsgefäß wurde 20 µl EDTA-Vollblut zusammen mit 50 µl NP 40 und 430 µl 6 M Guanidinumisothiozyanat gegeben und vorsichtig durch leichtes hin- und herbewegen gemischt. Nachdem das Gemisch für 10 min bei RT inkubiert worden war, wurde das gesamte Volumen auf die Glasmembran des „GlassMax spin cartridge" Systems überführt. Für 20 Sekunden wurde daraufhin bei 14000 rpm (RT) zentrifugiert. Die 500 µl Zentrifugat wurden dann nochmals auf die Membran pipettiert, und für 20 s bei 14000 rpm (RT) zentrifugiert. Danach wurde zweimal mit 70%-igem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde mit zwei Portionen, je 50 µl 70 °C warmes ddH2O, eluiert. Dazu wurde jeweils für 20 s bei 14000 rpm (RT) zentrifugiert.
     

    2.3.1.3 DNA-Isolierung aus Gewebeproben

    DNA wurde aus in Formalin fixierten und Paraffin gebetteten Kolontumor- und Normalkolongewebeproben mit Proteinase K modifiziert nach Jen et al. (1994) isoliert [83]. Aus einem Gewebeblock wurde ein ungefähr 27 mm3 Stück herausgetrennt, wobei möglichst viel randständiges Paraffin abgetrennt wurde. Mit einem Skalpell wurde dann das Gewebe möglichst klein zerteilt und in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. Durch Zugabe von 400 µl Xylol wurde das Paraffin aus dem Gewebe herausgelöst. Dies wird unterstützt durch ausgiebiges Schütteln des inhomogenen Gemisches für 15 Minuten. Dann wurde der Ansatz bei 14000 rpm (RT) für 5 Minuten zentrifugiert, und das Xylol abgehoben und verworfen. Die Schritte der Paraffinextraktion wurden insgesamt viermal durchgeführt. Das restliche Xylol wurde daraufhin zweimal mit 400 µl Ethanol abs. und nachfolgender Zentrifugation bei 14000 rpm (RT) für 5 min entfernt. Bei 37 °C wurde für 15 min das offene Reaktionsgefäß inkubiert, um eventuell wandhaftenden Ethanol zu eliminieren. Das Pellet wurde dann in 50 µl Proteinase K Puffer resuspendiert, und soviel Proteinase K hinzugegeben, daß diese in einer Endkonzentration von 500 µg/ml vorlag. Im Anschluß wurde das Gemisch bei 50 °C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde die DNA mit einem Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Gemisch aus dem Lysat extrahiert. Die wässrige, DNA-enthaltende Phase wurde dann mit Ethanol präzipitiert und in 70%-igem Ethanol gewaschen. Nach Lufttrocknung wurde das Pellet in 50 µl ddH2O resuspendiert.
     

    2.3.2 Oligonukleotid-Synthese

    Die selbstsynthetisierten Primer für die PCR mit Längen von 18 bis 33 bp sind auf einem Gene Assembler nach der Phosphor-Amidit-Methode hergestellt worden. Hierbei sind die Kartuschen zunächst für mindestens 24 h in 1 ml 32%-igem Ammoniak aufbewahrt worden. Gereingt wurde das Oligonukleotid daraufhin mit einer NAPâ -10 Säule. Die Säule wurde zunächst mit 6 ml 10 mM Na2HPO4-Puffer äquilibriert. Daraufhin wurde die Kartusche bei 14000 rpm zum Trocknen zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde zusammen mit der restlichen Ammoniaklösung auf die NAPâ -10 Säule gegeben. Zum eluieren der Primer wurden 1.5 ml 10 mM Natriumhydrogenphosphat-Lösung auf die Säule gegeben. Für die späteren PCR-Ansätze wurden die Primer auf eine Konzentration von 5 µM aliquotiert.
     

    2.3.3 Konzentrationsbestimmung von Primern

    Oligonukleotidkonzentrationen wurden bei der Wellenlänge von 260 nm und einer Verdünnung von 1:20 bis 1:50 im Spektralphotometer gemessen. Bei bekannter Sequenz ist nach unten genannter Formel die Konzentration bestimmt worden. Da die Extinktion (E260= Extinktion bei 260 nm) des Primers sowohl von der Länge als auch von der Basen- zusammensetzung abhängig ist, wurde die Anzahl der jeweiligen Base mit ihrem entsprechenen Extinktions- koeffizienzfaktor (e ) multipliziert.

Nukleotid
Extinktionkoeffizenzfaktor (e )
dATP
15.4 ml/µmol
dCTP
7.3 ml/µmol
dGTP
11.7 ml/µmol
dTTP
8.8 ml/µmol
 






2.3.4 Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA

Die Absorptionsmessungen erfolgten am Spektralphotometer bei den Wellenlängen von 260 nm und 280 nm. Die Konzentration wurden durch folgende Formel ermittelt:

E260* Verdünnung*50 (40) = Konzentration [µg/ml]

Bei zu messender dsDNA muß ein Faktor von 50 und bei RNA der Faktor 40 verwendet werden. Anhand des Quotienten aus E260nm/E280nm ist der Grad der Reinheit abzuschätzen. Dieser Wert sollte für DNA bei ungefähr bei 1.8 bis 2.0 liegen.
 

2.3.5 cDNA-Synthese

Mit Reverser Transkriptase wurde aus einzelsträngiger, relativ instabiler RNA cDNA hergestellt. In einem 0.5 ml Reaktionsgefäß wurde 500 ng RNA (1-5 µl) mit 150 ng „Random Hexameren" (2µl) versetzt, die als Zufalls- primer die Strangsynthese ermöglichen. Der Ansatz wurde mit ddH2O auf 12 µl aufgefüllt, mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet und für 10 min bei 70 °C inkubiert. Daraufhin wurde der Ansatz sofort auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 4 µl „First strand buffer" (GibcoBRL, Eggenstein), 2 µl 0.1 M DTT (GibcoBRL, Eggenstein) zur Strangstabilisierung und 1 µl dNTPs (10 mM) wurde der Reaktionsansatz auf 25 °C für 5 min äquilibriert. Durch die Zugabe von 1 µl (200 U) Super Script II Reverse Transkriptase wurde die enzymatische Strang- synthese initiiert. Danach wurde der Ansatz für weitere 10 min bei 25 °C gehalten. Daraufhin wurde die Elongation der Strangsynthese bei 42 °C für 50 min durchgeführt. Anschließend wurde das Enzym bei 70 °C für 15 min inaktiviert. Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes von 20 µl wurde daraufhin bei -20 °C gelagert.
 

2.3.6 Polymerasekettenreaktion

Zur enzymatischen Amplifikation von cDNA und DNA wurde die Polymeraseketten-reaktion (PCR) angewendet [184]. Die Reaktionsansätze hatten ein Gesamtvolumen von 50 µl, außer bei der PCR von Mikrosatelliten, welche in 25 µl Ansätzen amplifiziert wurden. Um Kondensationseffekten vorzubeugen, wurde der Ansatz mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet. Zur Vermeidung von Kontaminationen wurde ausschließlich mit autoklavierten Reaktionsgefäßen und Pipettenspitzen an speziell ausgewiesenen Arbeitsplätzen mit Pipetten, die ausschließlich für die PCR bestimmt waren, gearbeitet. Als Enzyme wurden Taq- , rTth- und Amplitaq Gold DNA-Polymerasen verwendet. Bei der rTth- und teilweise auch bei der Taq-Polymerase wurde ein sogenannter „Hot-Start" durchgeführt, bei dem die Polymerase nach einer Inkubation von 5 min bei 93 °C, bzw. 95 °C zugegeben wurde. Dieses Prinzip ist bei der AmpiTaq Gold automatisch durch eine Inkubation des Ansatzes inklusive Polymerase für 10 min bei 95 °C realisiert worden. Es wurden 40 bis 120 ng DNA eingesetzt. Die Primermenge betrug je Ansatz zwischen 5 und 20 pmol.

                      rTth                                   Amplitaq Gold                                   Taq
 
3.3x Puffer 15 µl 10x Puffer 5 µl 10x Puffer 5 µl
Mg2+-Acetat 2.2 µl MgCl2 10 µl MgCl2 1.5 µl
dNTP`s (10mM) 4 µl dNTP`s       (25 mM) 0.4 µl dNTP`s       (25 mM) 0.4 µl
Primer v 5-20 pmol Primer v 5-15 pmol Primer v  5-20 pmol
Primer r 5-20 pmol Primer r  5-15 pmol Primer v 5-20 pmol
DNA 40-100 ng DNA 40 ng DNA 40-100 ng
rTth 2 U Amplitaq Gold 0.65-1.25 U Taq 1.25 U
ddH2O add. 50 µl ddH2O add. 25-50 µl ddH2O add. 50 µl

Tab. 2.1: Reaktionsansätze für die verwendeten DNA-Polymerasen rTth, Taq und Amplitaq Gold. Primer v: Vorwärtsprimer, r: Rückwärtsprimer.
 

Die Reaktionen wurden, je nach verwendeten Enzym, in einem Minicycler nach folgenden Zyklusprogrammen durchgeführt:

Taq- und Amplitaq Gold Polymerase
rTth-Polymerase
Denaturierung 95 °C, 30 s-1.5 min
Denaturierung 93 °C, 1 min
Annealing X °C, 30 s-1.5 min 
Annealing und Elongation X °C, 3-5 min
Elongation 72 °C, 30 s-2.5 min
 
 
Die Temperatur der Denaturierung und Elongation ist durch das verwendete Enzym vorgegeben. Die Dauer der Elongation wurde je nach Länge des zu amplifizierenden Fragments gewählt. Die Annealing-Temperatur ist je nach Primersequenz und gewünschter Spezifität der Amplifikation eingestellt worden. Hierbei war die Schmelztemperatur (Tm) der als Primer verwendeten Oligonukleotide ein Anhalt für die vermutlich optimale Annealing-Temperatur. Für die Abschätzung der Schmelztemperatur gilt:
 
 

Tm= 4 *N(G+C) + 2 *N(A+T) (N= Anzahl der Basen)





Die hiernach benötigte Annealing-Temperatur liegt 5 °C unter der geschätzten Schmelztemperatur. Dieser Wert ist als Ausgangswert für die dann folgende Optimierung der PCR verwendet worden. Da die Amplifikation mit Hilfe der rTth-Polymerase eine sogenannte Zwei-Schritt-PCR ist, wobei Annealing und Elongation in einem Schritt ablaufen, wurde hier als Ausgangstemperatur für diesen gemeinsamen Schritt lt. Herstellerangaben 60 °C gewählt. Zur Verbesserung der Produktqualität folgte nach 20 bis 40 Zyklen ein „Final Extension"-Schritt von 10 bis 12 min bei 72 °C. Im Anschluß wurde der Ansatz auf 4 °C gekühlt und bei -20 °C gelagert.
 

2.3.6.1 Primer zur Amplifikation von cDNA-Fragmenten

Für die Amplifikation von cDNA Fragmenten von hMSH2 wurden die Primer MSH2-A, -D und MSH2-C wie zuvor von Liu et al. beschrieben verwendet [107,109]. Die Sequenz der Oligonukleotide MLH1-A bis -D für die Amplifikation von hMLH1 sind ebenfalls aus Publikationen übernommen worden [109]. Die Primer binden in der Reihenfolge A bis D in 5’-3’-Richtung in der Sequenz der Gene, wobei ihre Lage so gewählt ist, daß die entstehenden Amplifikate überlappen.

Primer Sequenz  
bp
Codons
Name
MSH2-A

MSH2-B

CAT GGC GGT GCA GCC GAA GG

CCT TGT AAA ACC TTC ATT TGA TCC T

v

r

1428
1-476
MSH-I
MSH2-C

MSH2-D

GAT TGT TAC CGA CTC TAT CAG

CCC AGT AAT GGA ATG AAG GTA ATA TTG ATA AGC

v

r

1636
315-935
MSH-II
MLH1-A

MLH1-B

CAT CTA GAC GTT TCC TTG GC

CAT CAA GCT TCT GTT CCC G

v

r

1217
1-394
MLH-I
MLH1-C

MLH1-D

GGG TGC AGC AGC ACA TCG

AAG TAT AAG TCT TAA GTG CTA CC

v

r

1423
324-766
MLH-II

Tab. 2.2: Primer für die Amplifikation von cDNA-Fragmenten. Die Sequenz ist in 5’-3’-Richtung angegeben. v: vorwärts Primer, r: rückwärts Primer, die Größe des entstehenden Amplifikats ist in Basenpaaren (bp) angegeben. Unter Codons sind die Tripletts der kodierenden Sequenz des Fragments angegeben. Name: Bezeichnung des bei Kombination der Primer entstehenden PCR-Produkts
 

Zur Amplifikation von cDNA Bereichen von hMSH2, hMLH1, hPMS1 und hPMS2, die später in einem IVSP-Assay eingesetzt werden sollten, sind ebenfalls zuvor beschriebene Primer verwendet worden [116,148]. Für APC wurde eigens entwickelte Primer verwendet, wobei die Amplifikation des Fragments sowohl mit cDNA als auch mit DNA möglich war. Der modifizierte Aufbau der IVSP-Vorwärtsprimer ist in Abbildung 2.1 ersichtlich.


Abb. 2.1: Primeraufbau für IVSP-Assay. Das Schema ist in 5’-3’-Richtung angegeben. Die Basensequenz GGATCC entspricht der Schnittstelle von BamH I. Mittig ist die Kozak-Konsensussequenz dargestellt, hervorgehoben ist das Basentriplett ATG, das in der folgenden Translation als Initiationsstelle fungiert. Die bindende Sequenz entspricht der genkodierenden Basenfolge, wobei diese in Abhängigkeit vom ATG Triplett „in-frame" zur Primersequenz paßt.
 

Die in dem Schema als komplementäre Sequenz bezeichnete Basenfolge wurde in Abhängigkeit von der Translationsinitiationsstelle so gewählt, daß die später daraus folgende Aminosäurenabfolge „in-frame" der Triplettzuordnung des physiologisch exprimierten Proteins entsprechend, translatiert wird. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2.3 zusammengestellt.
 
 

Fragment Primer Sequenz   Codons
bp
MSH2-1

 

MSH2-IVT-1s

MSH2-IVT-1as

GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA 

GAC CAC CAT GGC GGT GCA GCC GA
CAT CCT GGG CTT CTT CAT ATT CTG TTT TAT

v

r

1-609
1724
MSH2-2 MSH2-IVT-2s
 

MSH2-IVT-2as

GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC 

CAC CAT GGT TGG CTT GGA CCC TGG CAA AC
TCA ATA TTA CCT TCA TTC CAT TAC TGG GAT 
TT

v

r

503-935 
1330
MLH1-1 MLH1-IVT-1s

MLH1-IVT-1as

GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC

CAC CAT GGC ATC TAG ACG TTT CCT TGG C
CAT CAA GCT TCT GTT CCC G

v

r

1-394
1217
MLH1-2

 

MLH1-IVT-1s
 

MLH1-IVT-1as

GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC 

CAC CAT GGG GGT GCA GCA GCA CAT CG
GGA GGC AGA ATG TGT GAG CG

v

r

324-730
1218
PMS1-1 PMS1-IVT-1s

PMS1.IVT-1as

GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC

CAC CAT GGA ACA ATT GCC TGC GG
CCT GCT CCA CTC ATC TGC

v

r

1-500
1500
PMS1-2 PMS1-IVT-2s

PMS1-IVT-2as

GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC

CAC CAT GGA AGA TAT CTT AAA GTT AAT CCG
GGC TTC TTC TAC TCT ATA TGG

v

r

270-755
1457
PMS1-3 PMS1-IVT-3s

PMS1-IVT-3as

GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC

CAC CAT GGC AGG TCT TGA AAA CTC TTC G
AAA ACA AGT CAG TGA ATC CTC

v

r

484-933
1480
PMS2-1 PMS2-IVT-1s

PMS2-IVT-1as

GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC

CAC CAT GGA GCG AGC TGA GAG C
TTT CTG AGG TCT CAG GAC GC

v

r

1-472
1415
PMS2-2 PMS2-IVT-2s

PMS2-IVT-2as

GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC

CAC CAT GGT GTC CAT TTC CAG ACT GCG
AGG TTA GTG AAG ACT CTG TC

v

r

414-856
1325
APC-L APC-sense
 
 

APC4633L

GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC CAT GGG ACA AAG CAG TAA AAC CGA ACAT

TGA TTC TTT AGG CTG CTC TGA

v
 
 

r

1203-1545, 

Exon 15

1026

Tab. 2.3: Primer für die Amplifikation von IVSP-Fragmenten. Die Sequenz ist in 5’-3’ Richtung angegeben. Fragment: Nomenklatur des entstehenden PCR-Produkts, v: vorwärts Primer, r: rückwärts Primer, Codons: gibt die das PCR-Produkt überspannende kodierende Sequenz an, bp: bezeichnet die Größe des entstehenden Amplifikats in Basenpaaren.
 

2.3.6.2 Primer zur genomischen Amplifikation

Die Sequenz der Primer zur genomischen Amplifikation der Exons inklusive der angrenzenden Intronbereiche für hMSH2 und hMLH1 ist aus zuvor erschienenen Arbeiten übernommen worden [68,93,94]. Die Primerlage ist so gewählt, daß jeweils 24 bis 135 bp an Intronsequenzen in 5’- und 3’-Richtung vom Exon mit amplifiziert wird.
 

Exon
Primer Sequenz  
bp
Name
1
MSH2-1s

MSH2-1as

TCG CGC ATT TTC TTC AAC C

GTC CCT CCC CAG CAC GC

v

r

284
S-Ex 1
2
MSH2-2s

MSH2-2as

GAA GTC CAG CTA ATA CAG TGC

CTT CAC ATT TTT ATT TTT CTA CTC

v

r

285
S-Ex 2
3
MSH2-3s

MSH2-3as

GCT TAT AAA ATT TTA AAG TAT GTT C

GCC TTT CCT AGG CCT GGA ATC TCC

v

r

392
S-Ex 3
4
MSH2-4s

MSH2-4as

TTC ATT TTT GCT TTT CTT ATT CC

ATA TGA CAG AAA TAT CCT TC

v

r

315
S-Ex 4
5
MSH2-5s

MSH2-5as

CCA GTG GTA TAG AAA TCT TCG

CCA ATC AAC ATT TTT AAC CC

v

r

241
S-Ex 5
6
MSH2-6s

MSH2-6as

GTT TTC ACT AAT GAG CTT GCC

GTG GTA TAA TCA TGT GGG

v

r

250
S-Ex 6
7
MSH2-7s

MSH2-7as

GAC TTA CGT GCT TAG TTG

GTA TAT ATT GTA TGA GTT GAA GG

v

r

325
S-Ex 7
8
MSH2-8s

MSH2-8as

GAT TTG TAT TCT GTA AAA TGA GAT C

GGC CTT TGC TTT TTA AAA ATA AC

v

r

221
S-Ex 8
9
MSH2-9s

MSH2-9as

GTC TTT ACC CAT TAT TTA TAG G

GTA TAG ACA AAA GAA TTA TTC C

v

r

216
S-Ex 9
10
MSH2-10s

MSH2-10as

GGT AGT AGG TAT TTA TGG AAT AC

CAT GTT AGA GCA TTT AGG G

v

r

258
S-Ex 10
11
MSH2-11s

MSH2-11as

CAC ATT GCT TCT AGT ACA C

CCA GGT GAC ATT CAG AAC

v

r

197
S-Ex 11
12
MSH2-12s

MSH2-12as

ATT CAG TAT TCC TGT GTA C

CGT TAC CCC CAC AAA GC

v

r

326
S-Ex 12
13
MSH2-13s

MSH2-13as

CGC GAT TAA TCA TCA GTG

GGA CAG AGA CAT ACA TTT CTA TC

v

r

352
S-Ex 13
14
MSH2-14s

MSH2-14as

TAC CAC ATT TTA TGT GAT GG

GGG GTA GTA AGT TTC CC

v

r

352
S-Ex 14
15
MSH2-15s

MSH2-15as

CTC TTC TCA TGC TGT CCC

ATA GAG AAG CTA AGT TAA AC

v

r

260
S-Ex 15
16
MSH2-16s

MSH2-16as

TAA TTA CTC ATG GGA CAT TC

TAC CTT CAT TCC ATT ACT GG

v

r

229
S-Ex 16

Tab. 2.4: Primer für die Amplifikation der hMSH2-Exons. Die Sequenz der Primer ist in 5’-3’- Richtung angegeben. v: vorwärts Primer, r: rückwärts Primer, bp gibt die Größe des entstehenden Amplifikats in Basenpaaren an. Unter Name ist die Nomenklatur der entstehenden PCR-Produkte angegeben.
 
 

Exon
Primer Sequenz  
bp
Name
1
MLH1-1s

MLH1-1as

AGG CAC TGA GGT GAT TGG C

TCG TAG CCC TTA AGT GAG C

v

r

228
L-Ex 1
2
MLH1-2s

MLH1-2as

AAT ATG TAC ATT AGA GTA GTT G

CAG AGA AAG GTC CTG ACT C

v

r

212
L-Ex 2
3
MLH1-3s

MLH1-3as

AGA GAT TTG GAA AAT GAG TAA C

ACA ATG TCA TCA CAG GAG G

v

r

206
L-Ex3
4
MLH1-4s

MLH1-4as

AAC CTT TCC CTT TGG TGA GG

GAT TAC TCT GAG ACC TAG GC

v

r

225
L-Ex 4
5
MLH1-5s

MLH1-5as

GAT TTT CTC TTT TCC CCT TGG G

CAA ACA AAG CTT CAA CAA TTT AC

v

r

189
L-Ex 5
6
MLH1-6s

MLH1-6as

GGG TTT TAT TTT CAA GTA CTT CTA TG

GCT CAG CAA CTG TTC AAT GTA TGA GC

v

r

235
L-Ex 6
7
MLH1-7s

MLH1-7as

CTA GTG TGT GTT TTT GGC

CAT AAC CTT ATC TCC ACC

v

r

183
L-Ex 7
8
MLH1-8s

MLH1-8as

CTC AGC CAT GAG ACA ATA AAT CC

GGT TCC CAA ATA ATG TGA TGG

v

r

217
L-Ex 8
9
MLH1-´9s

MLH1-9as

CAA AAG CTT CAG AAT CTC

CTG TGG GTG TTT CCT GTG AGT GG

v

r

169
L-Ex 9
10
MLH1-10s

MLH1-10as

CAT GAC TTT GTG TGA ATG TAC ACC

GAG GAG AGC CTG ATA GAA CAT CTG

v

r

238
L-Ex 10
11
MLH1-11s

MLH1-11as

GGG CTT TTT CTC CCC CTC CC

AAA ATC TGG GCT CTC ACG

v

r

287
L-Ex 11
12
MLH1-12s

MLH1-12as

AAT TAT ACC TCA TAC TAG C

GTT TTA TTA CAG AAT AAA GGA GG

v

r

558
L-Ex 12
13
MLH1-13s

MLH1-13as

TGC AAC CCA CAA AAT TTG GC

CTT TCT CCA TTT CCA AAA CC

v

r

291
L-Ex 13
14
MLH1-14s

MLH1-14as

TGG TGT CTC TAG TTC TGG

CAT TGT TGT AGT AGC TCT GC

v

r

253
L-Ex 14
15
MLH1-15s

MLH1-15as

CCC ATT TGT CCC AAC TGG

CGG TCA GTT GAA ATG TCA G

v

r

180
L-Ex 15
16
MLH1-16s

MLH1-16as

CAT TTG GAT GCT CCG TTA AAG C

CAC CCG GCT GGA AAT TTT ATT TG

v

r

275
L-Ex 16
17
MLH1-17s

MLH1-17as

GGA AAG GCA CTG GAG AAA TGG G

CCC TCC AGC ACA CAT GCA TGT ACC G

v

r

227
L-Ex 17
18
MLH1-18s

MLH1-18as

TAA GTA GTC TGT GAT CTC CG

ATG TAT GAG GTC CTG TCC

v

r

246
L-Ex 18
19
MLH1-19s

MLH1-19as

GAC ACC AGT GTA TGT TGG

GAG AAA GAA GAA CAC ATC CC

v

r

269
L-Ex 19

Tab. 2.5: Primer für die Amplifikation der hMLH1-Exons. Die Sequenz der Primer ist in 5’-3’-Richtung angegeben. v: vorwärts Primer, r: rückwärts Primer, bp gibt die Größe des entstehenden Amplifikats in Basenpaaren an. Unter Name ist die Nomenklatur der entstehenden PCR-Produkte angegeben.
 

Zur Bestimmung des Mikrosatellitenstatus im Kolongewebe wurden zehn verschiedene, über das gesamte Genom verteilte, repetitive Sequenzen mit einer Größe von 80 bis 160 bp amplifiziert. Die Sequenz der Primer ist auch hier von verschiedenen Publikationen übernommen worden [26,42,108,206].
 
 

Mikrosatellit Lokus Sequenz  
bp
Referenz
BAT 25 4q12 TCG CCT CCA AGA ATG TAA GT

TCT GCA TTT TAA CTA TGG CTC

v

r

120
[42]
BAT 26 2p TGA CTA CTT TTG ACT TCA GCC

AAC CAT TCA ACA TTT TTA ACC C

v

r

120
[42]
BAT 40 1p13.1 ATT AAC TTC CTA CAC CAC AAC

GTA GAG CAA GAC CAC CTT G

v

r

120
[42]
Mfd 26 18q CAG AAA ATT CTC TCT GGC TA

CTC ATG TTC CTG GCA AGA AT

v

r

115
[206]
Mfd 27 5q GAT CCA CTT TAA CCC AAA TAC

GGC ATC AAC TTG AAC AGC AT

v

r

145
[206]
Mfd 41 17q CAG GTT CTG TCA TAG GAC TA

TTC TGG AAA CCT ACT CCT GA

v

r

159
[206]
Mfd 49 15q GAT AAA TGC CAA ACA TGT TGT

TGC TCT CAG GAT TTC CTC CA

v

r

87
[206]
D2S123 2p16 ACA TTG CTG GAA GTT CTG GC

CCT TTC TGA CTT GGA TAC CA

v

r

140
[108]
D3S1293 3p ACT CAC AGA GCC TTC ACA

CAT GGA AAT AGA ACA GGG T

v

r

132
[108]
D18S58 18q22.3 GCT CCC GGC TGG TTT T

GCA GGA AAT CGC AGG AAC TT

v

r

148
[26]

Tab. 2.6: Primer zur Amplifikation von Mikrosatelliten aus genomischer DNA. Die Sequenz aller Primer ist in 5‘-3‘-Richtung angegeben. Lokus: Chromosomale Lokalisation v: Vorwärtsprimer, r: Rückwärtsprimer, bp: Größe des entsehenden Amplifikats, Referenz: Publikation aus welcher die Sequenz der Primer übernommen wurde.
 

2.3.6.3 PCR-Bedingungen für die Amplifikation von cDNA

Die Zyklusanzahl, die Dauer der einzelnen Schritte, die Annealing-Temperatur, die Primermenge und das Enzym für die Amplifikation jedes Genbereichs ist für jedes Fragment einzeln in Abhängigkeit von der Produktqualität ermittelt worden. Alle cDNA Fragmente von hMSH2 und hMLH1 sind mit der „Hot-start"-Methode amplifiziert worden. Die Zyklusanzahl betrug bei den mit Taq-Polymerase amplifizierten Fragmenten MSH2-I, MSH2-II und MLH1-I 40. Wohingegen MLH1-II bei 35 Zyklen mit der rTth-Polymerase amplifiziert wurde. Die restlichen Parameter sind aus folgender Zusammenstellung zu entnehmen:
 
MSH2-I und Denaturierung: 1 min MLH1-I: Denaturierung: 1 min
MSH2-II: Annealing: 60 °C, 1 min   Annealing: 50 °C, 1 min
  Elongation: 2 min 30 s   Elongation: 2 min 30 s
  Primermenge: 10 pmol   Primermenge: 10 pmol
MLH1-II: Denaturierung: 1 min      
  Annealing und        
  Elongation: 62 °C, 4 min      
  Primermenge: 25 pmol      

Die Fragmente MSH2-1 und -2, MLH1-1 und -2 und PMS1-1, die später im IVSP-Assay eingesetzt werden sollten wurden mit der rTth-Polymerase, 10 pmol Primer und 35 Zyklen amplifiziert. Denaturiert wurde bei einer Temperatur von 93 °C für 5 min. Der Annealing-/ Elongationsschritt dauerte 3 min bei 62 °C. Die IVSP-Fragmente PMS1-2 , -3 und PMS2-2 wurden ebenfalls mit der rTth-Polymerase, 10 pmol Primer und 35 Zyklen amplifiziert. Einem Denaturierungsschritt bei 93 °C für 5 min, folgte ein Annealing-/Elongationsschritt von 60 °C für 4 min.
Das IVSP-Fragment PMS2-1 mußte mittels einer „Semi-nested"-PCR amplifiziert werden. Zunächst wurde der gesamte kodierende Bereich von PMS2 mit der rTh-Polymerase und jeweils 10 pmol der Primer PMS2-IVT-1s und PMS2-IVT-2as mit 35 Zyklen vervielfältigt. Der Annealing-/Elongationsschritt dauerte 5 min bei 60 °C. Nach vollendeter Reaktion wurde der Reaktionsansatz 1:100 verdünnt. Hiervon wurde 1 µl in den zweiten Schritt der PCR zur Amplifikation des PMS2-1 Fragments eingesetzt. Dieser wurde mit der Taq-Polymerase in 20 Zyklen und „Hot-Start"-PCR durchgeführt. Hierzu wurden 10 pmol der Primer PMS1-1s und PMS1-1as eingesetzt. Nach einer Denaturierung bei 95 °C für 1 min folgte ein Annealingschritt bei 52 °C für 1 min 30 s und ein Elongationsschritt bei 72 °C für 2 min.
Das Fragment APC-L wurde mit der Taq-Polymerase und „Hot-Start"-PCR mit 10 pmol Primer in 40 Zyklen vervielfältigt. Denaturiert wurde bei 95 °C für 1 min. Der Annealingschritt wurde bei 52 °C für 1 min und 30 s und der Elongationsschritt bei 72 °C ebenfalls für 1 min und 30 s durchgeführt.
 

2.3.6.4 PCR-Bedingungen für die Amplifikation genomischer DNA

Alle Exons von hMSH2 und hMLH1 sind mit Taq-Polymerase bei 40 Zyklen amplifiziert worden, wobei jeder der drei Zyklusschritte 30 Sekunden dauerte. Die Amplifikationsbedingungen sind in Tabelle 2.7 zusammengestellt.
 
 

Annealing-

temperatur

Primer-

menge

Hot-start
Fragment
48
10
ja
L-Ex 12
50
10
nein
S-Ex 4, S-Ex 5, S-Ex 9, S-Ex 10, S-Ex 11, S-Ex 16, L-Ex 16,

L-Ex 11, L-Ex 18

ja
S- Ex 8, S-Ex 14, S-Ex 15, L-Ex 13, L-Ex 14
15
nein
L-Ex 5, L-Ex 7, L-Ex 15
20
nein
L-Ex 2, L-Ex 3, L-Ex 9
52
10
nein
S-Ex 7, S-Ex 12
15
nein
S-Ex 6
ja
S-Ex 2, S-Ex 3
55
5
nein
S-Ex 13
10
nein
S-Ex 1, L-Ex 1, L-Ex 4, L-Ex 6, L-Ex 8, L-Ex 10, L-Ex 16,

L-Ex 17, L-Ex 19

Tab. 2.7: Amplifikationsbedingungen der genomischen hMSH2 und hMLH1 PCR Produkte geordnet nach der Annealingtemperatur. Primermengen sind in pmol angegeben, die Annealingtemperatur in Grad Celsius. Die Nomenklatur der Fragmente entspricht Tabelle 2.4 und 2.5.
 

Die Mikrosatelliten wurden in 25 µl Ansätzen mit 35 Zyklen und Amplitaq Gold-Polymerase amplifiziert. Die Dauer des Denaturationschritts betrug ebenso wie der des Annealings- und Elongationsschritts 45 Sekunden. In einem Ansatz wurden mindestens 100 ng DNA eingesetzt. Mit Ausnahme der Mikrosatelliten BAT 25, 26 und Mfd 41, deren Annealingtemperatur 50 °C betrug, wurden alle anderen PCR-Produkte bei einer Annealingtemperatur von 55 °C vervielfältigt.
 

2.3.7 Reinigung von Nukleinsäuren

2.3.7.1 Phenolextraktion

Zur Entfernung von Proteinen aus RNA-oder DNA-Proben wurde eine Phenolextraktion nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt [185]. Hierbei wird dasselbe Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) der nukleinsäurehaltigen Lösung zugesetzt, gemischt und danach bei 14000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Die obere, die Nukleinsäuren enthaltende Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dann wurde die Probe nochmals mit einem gleichen Volumen Chloroform versetzt. Nach wiederholter Zentrifugation wurde die obere Phase zuletzt in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
 

2.3.7.2 Alkoholische Präzipitation

Der DNA-haltigen Lösung wurde Natriumacetat bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 0.3 M zugegeben. Zur Fällung wurde der DNA das 2.5-fache Volumen Ethanol abs. oder das gleiche Volumen Isopropanol zugesetzt. Zu dem Ansatz wurde dann 1µl Glykogen-Lösung (20 mg/ml) gegeben. Der Reaktionsansatz wurde daraufhin entweder bei -70 °C für eine Stunde oder bei -20 °C über Nacht inkubiert und im Anschluß bei 4 °C und 14000 rpm für 30 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet durch zweimalige Zugabe von 0.5 bis 1 ml 70%-igem Ethanol, anschließendem Mischen und folgender Zentrifugation bei 14000 rpm für 3 Minuten gewaschen. Das Pellet wurde luftgetrocknet und in 10 bis 50 µl ddH2O oder TE-Puffer resuspendiert.
 

2.3.7.3 Reinigung von PCR-Produkten

Um eventuell störende Salze und Nukleotide vom PCR-Produkt zu trennen wurde das PCR Produkt über einen Centriconâ 100 (Ausschlußgröße 100 kDa) Membranzylinder aufgereinigt. Hierzu wurde das ölfreie PCR-Produkt auf die Membran gegeben und 2 ml ddH2O dazupipettiert. In einem starren System wurde der Zylinder bei 3500 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, wodurch die größeren PCR-Produkte von den Oligonukleotiden und Salzen durch die Membran getrennt werden. Die Flüssigkeit des Auffangzylinders wurde verworfen. Dann wurde zweimal ddH2O zugegeben und zentrifugiert. Die PCR-Produkte wurden daraufhin aus der Membran herausgelöst, indem das Membransystem um 180° gewendet und bei 4000 rpm zentrifugatiert wurde.
 

2.3.8 Hydrolyse von DNA mittels Restriktionsendonukleasen

PCR-Produkte oder Plasmid-DNA wurde in Reaktionsvolumina von 10 bis 30 µl mittels Restriktionsendonukleasen sequenzspezifisch gespalten. Die Reaktion wurde bei einer für das Enzym optimalen Temperatur von 37 °C, 50 °C oder 65 °C durchgeführt. Dem Reaktionsanstz wurde entsprechend einem vom Hersteller mitgelieferter Puffer zugesetzt. Bei einigen Enzymen wurde 1/10 des Reaktionsvolumens BSA-Lösung zugegeben. Je nach Enzym wurde für eine bis acht Stunden inkubiert. Die Reaktionsansätze, die bei 50 °C und darüber inkubierten, wurden mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet. Sollte Plasmid-DNA hydrolysiert werden, so wurden 3 µl, bezogen auf einen 10 µl Ansatz, der Plasmid-Suspension eingesetzt. Bei PCR-Produkten ist sieben bis acht µl eingesetzt worden. Der Restriktionsverdau wurde anschließend auf einem Agarosegel kontrolliert.
 

2.3.9 Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsäuren

DNA-Fragmente wurden, je nach zu erwartender Fragmentgröße, in einem 0.8 bis 2.8%igem (w/v) Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Agarose wurde in TAE-Puffer durch Erhitzen gelöst und dann 0.5 µg/ml Ethidiumbromid dazugegeben. Nach Abkühlung auf unter 55 °C wurde die Agarose in horizontale Gelformen gegossen. Wenn die Agarose erstarrt war, wurde das Gel zwischen die Elektroden der Elektrophoresekammer gelegt. Je nach aufzutennender Probe wurden 2 bis 30 µl mit 1/10 Ladepuffer versetzt und in die Taschen des Gels pipettiert. Um die Länge von DNA-Fragmenten abzuschätzen, wurden DNA-Längenstandarts aufgetragen, die entweder die Größen 220 bp bis 12 kb, 100 bp bis 2072 bp oder 10 bp bis 200 bp durch verschiedene Banden wiederspiegeln. Die Auftrennung der Proben erfolgte bei einer Spannung von 6 bis 8 V/cm Längskantenlänge des Gels mit TAE-Puffer als Laufpuffer. Die Fragmente wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht und zur Dokumentation fotografiert.
 

2.3.10 Heteroduplexanalyse

Zur Mutationsdetektion in dsDNA-Proben basiert die Heteroduplexanalyse auf der Ausbildung von Heteroduplices zwischen zwei DNA-Strängen nach vorhergehender Denaturierung [87,145]. Die zu analysierenden PCR-Produkte wurden zunächst mit Phenol/Chloroform extrahiert, dann mit Ethanol präzipitiert und in einem Fünftel des Ausgangsvolumens resuspendiert. Ein Aliquot des PCR-Produkts wurde in einem Restriktionsendonukleasenansatz hydrolysiert, wovon dann 10 µl bei 100 °C im Wasserbad für 5 Minuten inkubiert wurden. Der Reaktionsansatz wurde zur besonders langsamen Abkühlung auf RT in dem zuvor kochenden Wasserbad über Nacht belassen. Bei der Re-assoziation entstehen bei Punktmutationen oder kleinen Deletionen neben den zu erwarten-den Homoduplices auch Heteroduplices, welche verschiedene Wanderungsverhalten bei elektrophoretischer Auftrennung aufweisen [145]. Die nicht-denaturierenden Acrylamidgele wurden als 100 ml-Ansätze zwischen 400 mm x 200 mm große ethanolgereingte Glasplatten mit Abstandhaltern einer Dicke von 1 mm kurz nach Zugabe von TEMED und 10%-iger APS-Lösung gegossen. Nachdem das Gel eine Stunde polymerisierte, wurde der 10 µl De-/Renaturierungsansatz mit 2 µl Ladepuffer versetzt und auf das vertikal eingespannte Gel aufgetragen. Mit 0.6x TBE-Laufpuffer wurden die Proben für 20 Stunden bei konstant 500 V aufgetrennt. Im Anschluß wurden die Banden durch eine Silberfärbung visualisiert.
 

2.3.11 IVSP-Assay

Durch den „In vitro synthetisierten Protein"-Test (IVSP) lassen sich Nonsense-Mutationen in cDNA oder DNA durch verkürzte Proteinprodukte nachweisen [176,182]. Die Proteinherstellung erfolgt durch eine gekoppelte in vitro Transkription und Translation (TnTâ Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega). Hierbei sind PCR-Produkte eingesetzt worden, welche mit dem unter 2.3.6.1 beschriebenen Vorwärtsprimer amplifiziert wurden [95]. Durch diese Modifikationen ist es möglich, in der Folge die PCR-Produkte mit der T7-Polymerase zu transkribieren und die RNA im Anschluß in einem Retikulozytenlysat zu translatieren. Die hierbei entstehenden Proteine wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Jedes Fragment wurde in zwei Ansätzen amplifiziert die anschließend vereinigt wurden, so daß eine Gesamtmenge von 100 µl entstand. Nachdem das Mineralöl vom PCR-Reaktionsansatz abgehoben wurde, ist der Ansatz durch eine Phenolextraktion gereinigt worden. Das PCR-Produkt ist daraufhin in 11 µl TE-Puffer resuspendiert worden. 1 µl wurde in einem 1.5%-igem Agarosegel zur Kontrolle der PCR aufgetrennt. In der anschließenden gekoppelten in vitro Transkription/Translation wurde mindestens 1.8 µg PCR-Produkt eingesetzt, mit dem Ziel, später detektierbare, ausreichende Proteinmengen zu synthetisieren. Folgender Reaktionsansatz ist daraufhin für 90 Minuten bei 30 °C inkubiert worden:
 

Hasen Retikulozytenlysat
12.5 µl
Reaktionspuffer (Promega)
1 µl
T7-RNA Polymerase
0.5 µl
Aminosäuren (Met-) (1mM)
0.5 µl
35S-Methionin (>1000 Ci/mmol)
2 µl
RNAse Inhibitor (40 U/µl)
0.5 µl
PCR-Produkt
1.8 µg
H2O
add 25 µl

5 µl des Reaktionsansatzes wurden daraufhin mit 15 µl Probenpuffer versetzt und für fünf Minuten auf 100 °C erhitzt worden. Die restliche Probe wurde bei -20 °C gelagert. Die denaturierten Proteine sind radioaktiv auf ein 12.5%- oder 15%-iges SDS-Acrylamidgel aufgetragen worden. Als Längenstandard ist ein „high range" Rainbow-Protein-Längenstandard verwendet worden. Die Proben wurden bei einer Stromstärke von 10 mA im Sammelgel und dann bei 20 mA im Trenngel aufgetrennt, bis die 14.3 kD-Bande des Rainbow-Längenstandards den Unterrand des Gels erreicht hatte. Das Gel wurde daraufhin auf ein Filterpapier gelegt und mit Klarsichtfolie bedeckt und für 90 Minuten vakuumgetrocknet. Die Detektion der Proteine erfolgte autoradiografisch, wobei das während der Translation in die Polypeptidketten eingebaute, radioaktiv markierte Methionin nachgewiesen wurde. Das getrocknete Gel wurde für 18 Stunden bis zwei Tage bei -70 °C auf einem Röntgenfilm exponiert.
 

2.3.12 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese von Proteinen

Für die Auftrennung der im IVSP-Test gebildeten Proteine wurde eine Polyacrylamid-Gel Elektrophoese (PAGE) in einem Minigel der Größe 100 x 70 x 0.75 mm durchgeführt. Nachdem 6 ml 12.5%- oder 15%-ige Trenngellösung polymerisierte, wurden 2 ml der Sammelgellösung auf das Trenngel gegeben. Nachdem auch dieses polymerisierte, wurde an das Gel, ohne aufgetragene Proben, eine Stromstärke von 7 mA für 10 Minuten angelegt. Die zu untersuchenden Proben sind nach Zugabe von Probenpuffer für 5 Minuten bei 100 °C denaturiert und vollständig aufgetragen worden. Solange sich die Proben in dem Sammelgel befanden, wurde eine Stromstärke von 10 mA angelegt. Im Trenngel wurde die Stromstärke auf 20 mA erhöht. Nach der Elektrophorese ist das Gel auf ein Filterpapier übertragen, mit Klarsichtfolie bedeckt in einem Vakuumgeltrockner (-1 bar) bei 80 °C für 90 Minuten getrocknet worden.
 

2.3.13 SSCP-Analyse

Die „Single-Strand-Conformation-Polymorphism"-Analyse (SSCP) ist eine Methode um Polymorphismen, Punktmutationen oder auch kleine Deletionen in dsDNA kleinerer PCR-Fragmente zu detektieren [158]. Zur Denaturierung der zu untersuchenden DNA-Fragmente wurden 2.5 bis 5 µl PCR-Produkt, je nach Intensität der Bande im vorausgegangenen Agarosegel, mit 8 µl SSCP-Stop-Lösung versetzt. Diese verhindert durch das Formamid in alkalischer Lösung eine Reassoziation der durch das folgende Erhitzen entstehenden DNA-Einzelstränge. Der Reaktionsansatz wurde nach fünfminütige Denaturierung bei 100 °C zügig auf Eis gestellt. Analysiert wurden die Proben in einem 0.6x MDEâ -Acrylamid-Gel bei nicht denaturierenden Bedingungen. Nach 90 Minuten war das 400 mm x 200 mm x 1 mm große Gel polymerisiert. Daraufhin wurden 10 µl des eisgekühlten Probengemisches in die Geltaschen pipettiert. Mit 0.6x TBE-Puffer als Laufpuffer wurden konstant 4.8 Watt für 14 Stunden angelegt. Die aufgetrennten Einzelstränge wurden daraufhin durch eine Silberfärbung sichtbar gemacht.
 

2.3.14 Silberfärbung von Acrylamidgelen

Zur Detektion von elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Proben in Acrylamidgelen wurden Reagentien von BioRad verwendet. Heteroduplex- und SSCP-Gele sind mit „Silver Stain" gefärbt worden. Das Herstellerprotokoll ist mit Ausnahme der Erhöhung der Anzahl der Waschschritte von drei auf fünf streng eingehalten worden. Acrylamidgele der Mikrosatellitenanalysen wurden nach Herstellerangaben mit „Silver Stain Plus" gefärbt. Alle Schritte der Färbungen wurden auf einem horizontalen Schütteltisch in einer Glasschale durchgeführt. Zuletzt wurde das Acrylamidgel feucht in Plastikfolien eingeschweißt und lichtgeschützt aufbewahrt.
 

2.3.15 Klonierung von PCR-Produkten

2.3.15.1 Ligation von PCR-Produkten

Zum Klonieren von PCR-Produkten wurde das TA-Cloningâ Kit (Invitrogen, NV Leek, NL) verwendet. Hierbei wird das PCR-Produkt in einen pCR IIâ oder pCR 2.1â linearisierten Plasmid eingebracht (Abb. 2.2). Die Ligation wird ermöglicht durch von der Taq-Polymerase an die 3‘-Enden des PCR-Produkts zusätzlich angehängte Adenosinreste und entsprechenden Thymidinresten an den 3‘-Enden des linearisierten Plasmids. Die Ligation wurde in einem Gesamtvolumen von 10 µl in einem 0.5 ml Reaktionsgefäß mit folgender Zusammensetzung durchgeführt:
 

PCR-Produkt 3 µl
10x Ligationspuffer 1 µl
pCRâ 2.1 Vektor (25 ng/µl) 2 µl
ddH2O 3 µl
T4-DNA-Ligase 1 µl

Unabhängig von der Konzentration wurde immer 3 µl PCR-Produkt eingesetzt. Der Reaktionsansatz wurde bei 14 °C über Nacht inkubiert.
 
 




Abb. 2.2: pCRâ II Vektorkarte. Oben detailliert dargestellt ist die an das zu ligierende PCR-Produkt direkt angrenzende Sequenz des Plasmids. Erkennbar sind der Sp6 und T7 Promoter und die das PCR-Produkt flankierenden Schnittstellen von EcoRI. Die Sp6 Sequenz fehlt im pcRâ2.1 Vektor. Im Vektorring steht lac für die durch ein ligiertes PCR-Produkt unterbrochene Sequenz der b -Galaktosidase für eine Blau/Weiß Selektion. Ampicillin und Kanamycin symbolisiert die Genbereiche für einsprechende Antibiotikaresistenzen. ColE1 ori bezeichnet den regulierenden Bereich für die Plasmidreplikation.
 

2.3.15.2 Transformation kompetenter Bakterien

Bei allen in der Folge beschriebenen Arbreiten mit Bakterien wurde ausschließlich mit sterilen Plastikwaren und autoklavierten Lösungen gearbeitet. Häufig verwendete Gegenstände wurden zwischen jedem Arbeitsschritt durch Eintauchen in Isopropanol und folgendem Erhitzen über einer Flamme sterilisert. Als kompetente Bakterien wurden INVaF' One Shotâ Escherichia coli (Invitrogene, NV Leek, NL) verwendet. Die in 50 µl Aliquots bei -70 °C gelagerten Bakterien wurden auf Eis aufgetaut. Zunächst wurde 2 µl 0.5 M b -Mercaptoethanol zugegeben und vorsichtig mit den Bakterien vermischt. 2 µl Ligationsansatz wurde dazupipettiert und durch leichtes hin- und herbewegen mit der Bakteriensuspension vermischt. Nachdem der Reaktionsansatz für 30 Minuten auf Eis inkubiert worden war, wurde die Bakteriensuspension für 30 Sekunden auf 42 °C im Wasserbad erhitzt und für 2 Minuten zurück auf Eis gestellt. Es wurde dann 250 µl SOC-Medium dazugegeben und der Ansatz für eine Stunde bei 200 rpm im Schüttler bei 37 °C inkubiert. Im Anschluß wurden 50 µl bzw. 200 µl des Ansatzes auf jeweils eine LB-Agarplatte mit einer Antibiotikakonzentration von 50 µg/ml Kanamycin oder Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Bei einer Blau/Weiß-Selektion wurde 40 µl einer 40 mg/ml X-Gal enthaltenden Lösung auf die Agarplatten ausgestrichen. Die Platten wurden mindestens eine Stunde bei 37 °C gelagert, um das X-Gal einziehen zu lassen, bevor die Bakterien ausplattiert wurden.
 

2.3.15.3 Blau/Weiß-Selektion von Bakterienkolonien

Zur Unterscheidung der Bakterienkolonien, die mit einem das Insert enthaltenden Plasmid transformiert wurden, von den Kolonien, bei denen die Ligation oder die Transformation nicht erfolgreich war, diente die Blau/Weiß-Selektion. Diese basiert auf der Tatsache, daß b -Galaktosidase X-Gal zu einem blauen Farbstoff umsetzt. Wie in Abbildung 2.2 zu erkennen ist, wird die kodierende Sequenz für die Galaktosidase im pCRâ II oder 2.1 Vektor durch ein ligiertes PCR-Produkt unterbrochen. Dies hat zur Folge, daß Bakterienkolonien welche auf X-Gal enthaltenden Agarplatten wachsen, weiß erscheinen, wenn sie ein Insert-haltiges Plasmid besitzen. Entsprechend blau erscheinen Kolonien, welche ein Insert-freies Plasmid tragen.
 

2.3.15.4 „Colony-Screening"

Als Sonde für das „Colony-Screening" wurde folgendes Oligonukleoid radioaktiv markiert:

5‘-CAT ATC CAA TGC AAA CTA CT-3‘

Diese innerhalb von Exon 9 des hMSH2 Gens bindende Sonde wurde an der 5‘-OH-Gruppe mit g -32P-ATP phosphoryliert. Der Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:
 

Oligonukleotid (3.7 ng/µl)
2.7 µl
10x Kinase-Puffer
1.5 µl
T4-Polynukleotid-Kinase (10 U/µl)
1.5 µl
g -32P-ATP (10 µCi/µl)
7.5 µl
ddH2O
1.8 µl

Der Reaktionsansatz mit einem Gesamtvolumen von 15 µl wurde für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Kinase wurde danach bei 65 °C für 5 Minuten inaktiviert. Zum Abtrennen nicht eingebauter Radioaktivität wurde das Oligonukleotid mit einer NAPâ -5 Säule gereinigt. Diese wurde zunächst mit TE-Puffer äquilibriert. Zu den 15 µl des Reaktionsansatzes wurden 485 µl TE-Puffer gegeben. Das Gesamtvolumen von 500 µl wurde dann auf die Säule gegeben, wodurch Salze und nicht eingebaute Nukleotide entfernt wurden. Das radioaktiv markierte Oligonukleotid wurde zuletzt mit 1 ml TE-Puffer eluiert.
Für das „Colony-Screening" wurde ein Nitrozellulose-Filter luftblasenfrei auf eine mit Bakterienkolonien bewachsenen LB-Agarplatte gelegt. Um eine spätere Zuordnung der autoradiografischen Signale auf dem Röntgenfilm mit den Bakterienkolonien zu ermöglichen, wurden je Platte drei Markierungspunkte mit Tinte im Agar und auf dem Filter gesetzt. Der Filter wurde abgezogen und daraufhin nacheinander in folgende drei Lösungen gelegt, wobei er zwischen jedem Schritt luftgetrocknet wurde.
 

Lösung 1
Lösung 2
Lösung 3
0.5 M NaOH
0.5 M Tris-HCl
0.2 M Tris-HCl
1.5 M NaCl
1.5 M NaCl
2x SSC
 
pH 8.0
pH 7.5
2 min
5 min
1 min

In Lösung 3 wurde der Filter zweimal gelegt. Die Nitrozellulosemembran wurde dann in Filterpapier eingepackt und im Vakuumofen bei 80 °C und -1 bar inkubiert. Die Nitrozellulose wurde daraufhin bei 42 °C mit 10 ml Rapid-Hyb-Buffer im Hybridisationsofen prähybridisiert. Eine entsprechende Menge des o.g. radioaktiv markierten Oligonukleotids wurde mit weiteren 10 ml Rapid-Hyb-Buffer versetzt, so daß eine Endaktivität von 1-3 * 106 cpm/ml erreicht wurde. Die Nitrozellulosemembranen wurden bei 42 °C für 2 Stunden in der Hybridisierlösung mit der Sonde inkubiert. Die Temperatur ergab sich aus der Formel unter 2.3.6, wobei sich die Hybridisierungs-temperatur aus TM -10 °C errechnet. In der Folge wurden die Membranen bei 50 °C gewaschen, was ungefähr der Temperatur TM entspricht. Hierzu wurden die Nitrozellulose-membranen dreimal mit 2x SSC, 0.1% (w/v) SDS-Lösung für 5 Minuten gewaschen. Anschließend wurden die Membranen zweimal mit 1x SSC, 0.1% (w/v) SDS-Lösung für 15 Minuten inkubiert. Die Membranen wurden dann feucht eingeschweißt und über Nacht auf einem Röntgenfilm exponiert. Durch die vorherigen Markierungen war nach der Filmentwicklung eine Zuordnung der autoradiografischen Signale zu Bakterienkolonien möglich. Mit den positiven Kolonien wurde wie unter 2.3.15.5 beschrieben weiterverfahren.
 

2.3.15.5 Zwischenkultur von Bakterienklonen

Je nach Auswahlkriterium Blau/Weiß-Selektion oder „Colony-Screening" wurde mit einem sterilen Zahnstocher entsprechend positive Bakterienkolonien von der LB-Agarplatte in 2 ml LB-Medium, das Kanamycin oder Ampicillin in einer Konzentration von 50 µg/ml enthält, überführt. Die Zellsuspension wurde daraufhin über Nacht bei 37 °C in einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die Bakteriensuspension in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt, bei 14000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert, und der Überstand abgenommen. Das Bakterienpellet wurde entweder sofort weiter bearbeitet oder bei -20 °C gelagert.
 

2.3.16 Isolation von Plasmid-DNA

Mit Hilfe der Alkalischen Lyse nach Birnboim und Doly (1997) wurde Plasmid-DNA isoliert [12]. Hierbei wird Plasmid-DNA, von linearisierter DNA und Proteinen bzw. Zelldetritus durch folgende drei Lösungen getrennt.
 

Lösung 1
Lösung 2
Lösung 3
380 mM Tris-HCl
0.2 M NaOH
3 M Kaliumacetat
150 mM EDTA
1% (w/v) SDS
11.5% (v/v) Essigsäure
16 mM Glucose
   
pH 8.0
   

Das Bakterienpellet aus der Zwischenkultur wurde in 100 µl eisgekühlter Lösung 1 resuspendiert und 5 Minuten bei offenem Deckel bei RT inkubiert. Daraufhin wurde 200 µl Lösung 2 dazupipettiert. Die Lösungen wurden vorsichtig durch antippen gemischt. Die Zellen wurden dann mit 150 µl Lösung 3 endgültig lysiert. Der Reaktionsansatz wurde dann für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde bei 14000 rpm für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, wodurch die Plasmid-DNA von der linarisierten DNA und den denaturierten Proteinen getrennt wird. Die wäßrige Phase wurde in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt, und eine Phenolextraktion durchgeführt. Die obere Phase wurde abgehoben und mit demselben Volumen Isopropanol versetzt. Der Ansatz wurde 10 Minuten bei RT inkubiert und daraufhin bei 14000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet dann in 100 µl TE-Puffer resuspendiert. Zur weiteren Reinigung der DNA wurde eine alkoholische Fällung mit Ethanol abs. unter Zugabe von 1 µl RNAse, DNAse-frei durchgeführt. Die Fällung erfolgte bei -20 °C über Nacht. Es folgte eine Zentrifugation bei 14000 rpm für 15 Minuten bei 4 °C. Anschließend wurde das Pellet in 20 bis 50 µl ddH2O resuspendiert. Zur Überprüfung, ob das vermutete Insert tatsächlich im Plasmid vorliegt, wurde ein Aliquot von 3 µl in einen 10 µl Ansatz eines Restriktionsverdaus mit EcoRI eingesetzt (Schnittstellen von EcoRI: siehe Abb. 2.2). Der Restriktionsverdauansatz wurde in einem 2%-igem Agarosegel aufgetrennt und das Insert als Fragment einer bestimmten Größe nachgewiesen.
 

2.3.17 DNA-Sequenzierung

Die DNA wurde nach der Dideoxy-Methode sequenziert [187]. Hierbei kommt es durch den Einbau von 2‘-3‘-Dideoxy- nukleotiden (ddNTPs) anstelle normaler dNTPs während der Sequenzierungsreaktion zu statistisch zufälligen Kettenabbrüchen. Diese unterschiedlich langen DNA-Fragmente können dann elektrophoretisch aufgetrennt werden. Die Sequenzierungs- reaktionen von PCR-Produkten und Plasmid-DNA wurden mit DyeDeoxy-Terminatoren durchgeführt. Diese mit vier verschiedenen Fluoreszensfarbstoffen markierten ddNTPs wurden mit Hilfe der Amplitaq DNA-Polymerase, FS durch zyklische Sequenzierung in die Amplifikate eingefügt. Mit Ausnahme des Primers sind alle notwendigen oben genannten Komponenten dieser Sequenzierungsreaktion im ABI PRISMâ „Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Perkin Elmer, Langen) enthalten:
 


Es wurde 3 bis 4 µl Plasmid-DNA oder 3 bis 10 µl, zuvor durch Centriconâ 100 gereinigtes, PCR-Produkt in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt. Zusammen mit 10 pmol Primer und 8 µl Terminator „Ready Reaction Mix" wurde der Reaktionsansatz mit ddH2O auf 20 µl Gesamtvolumen aufgefüllt. Als Primer wurde bei zuvor klonierten PCR-Produkten T7- oder Sp6-Oligonukleotide verwendet. Wenn direkt vom PCR-Produkt sequenziert wurde, so sind nach vorheriger Centriconâ 100 Aufreinigung die unter 2.3.6.1 aufgeführten Oligonukleotide verwendet worden. Mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet wurde der Reaktionsansatz im Thermocycler mit folgenden Bedingungen linear amplifiziert:

Denaturierung: 96 °C, 30 s
Annealing: 50 °C, 15 s
Elongation: 60 °C, 4 min

Nach 25 Zyklen wurde der Reaktionsansatz bei 4 °C zwischengelagert. Im Anschluß wurde der Ansatz mit Ethanol abs. versetzt und für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wurde das Pellet einmal mit 70%-igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde daraufhin luftgetrocknet. Die weitere Analyse erfolgte mit einem DNA Sequenzautomaten (373A oder 377 von Applied Biosystems/ABI PRISM) im Servicelabor des Instituts für Zellbiochemie und klinische Neurobiologie des Universitäts- krankenhauses Hamburg-Eppendorf. Die Sequenzierdaten wurden manuell und mit Hilfe des Programms MacMolly, Version 3.5 ausgewertet.
 

2.3.18 RFLP-Analyse

Die in dieser Arbeit durchgeführte Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus-Analyse (RFLP) wurde modifiziert auf Basis eines bei Exon 11 von hMSH2 liegenden PCR-Produkts durchgeführt. Diese Methode basiert auf einer enzymatischen Amplifizierung des zu untersuchenden DNA Fragments mit teilweise fehlgepaarten Primern. Hieraus folgt eine artifizielle Schnittstelle einer Restriktionsendonuklease, welche einen Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus entstehen läßt, der die zu untersuchende Punktmutation anzeigt [98,99]. Diese RFLP-Analyse sollte zum gezielten Familienscreening für eine zuvor identifizierte Glu580à Stop Punktmutation verwendet werden. Es wurde Exon 11 von hMSH2 mit folgenden Primern amplifiziert:

Vorwärtsprimer: „RFLP-MSH2-11s"

GTT TCA CGT AGT ACG AAT CGC TTC TAG TAC AC Rückwärtsprimer: „RFLP-MSH2-11as"

TCT ATT AAG TTT ACC TGA AGA GAT ATG AAC AAT TT
 

Beide Oligonukleotide sind in 5’-3’- Richtung angegeben. Unterstrichen sind die Basenfehlpaarungen zwischen dem Primer und der Originalsequenz, fettgedruckt ist die Erkennungsregion des Enzyms Xmn I. Für die PCR wurde die Amplitaq Gold mit 15 pmol je Primer und 40 ng DNA verwendet. Die zyklische Amplifizierung wurde bei 40 Zyklen unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Denaturierung: 95 °C, 1min
Annealing: 50 °C, 1 min, 30 s
Elongation: 72 °C, 1 min, 30 s

Das so entstandene, 184 bp große, PCR-Produkt wurde dann in einem 20 µl-Ansatz bei 37 °C für zwei Stunden hydrolysiert. Im o.g. Vorwärtsprimer ist eine Schnittstelle für Xmn I als Verdaukontrolle vorhanden, so daß bei erfolgreichem Restriktionsverdau ein 20 bp großes Fragment vom PCR-Produkt abgetrennt wird (Abb. 2.3). Die Lage der Schnittstelle von Xmn I im o.g. Rückwärtsprimer wurde so gewählt, daß die letzte Base der Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms (Cytosin, bzw. Guanin) die erste, an den Primer angrenzende, Base der kodierenden Sequenz ist. Diese Nukleinsäure an Position 1738 bp der kodierenden Sequenz von hMSH2 ist, wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, bei einigen Familienmitgliedern mutiert. Liegt die Wildtypsequenz vor (rückwärts-komplementär Cytosin) so trennt das Restriktionsenzym, zusätzlich zum 20 bp Fragment des Vorwärtsprimers, ein 31 bp großes Fragment ab, so daß nach dem Restriktionsverdau bei der Wildtypsequenz ein Fragment der Länge 133 bp entsteht.
 
 

Abb. 2.3: Schematische Darstellung der amplifizierten Genregion des Exon/Intron-Bereichs von hMSH2. Xmn I bezeichnet die Schnittstellen des Enzyms, die 20, bzw. 31 bp von den Rändern des PCR-Produkts entfernt sind. Die 5‘- gelegene Schnittstelle fungiert als Verdaukontrolle, wohingegen die 3‘- gelegene Xmn I Erkennungssequenz eine Base nach der zu untersuchenden Mutation bei 1738 bp beginnt. Diese Schnittstelle ist ist vorhanden bei der Wildtypsequenz, wohingegen sie wegfällt im Falle einer vorhandenen Mutation.
 

Beim Vorliegen der Glu580à Stop Mutation an der Stelle 1738 bp findet sich keine Cytosin, sondern eine Adenin Base (rückwärts-komplementär), so daß die zweite Schnittstelle von Xmn I wegfällt. Im heterozygoten Fall wäre somit ein Fragment der Länge 133 bp (Wildtyp) und ein weiteres der Länge 164 bp (Mutante) zu finden (Abb. 2.3 und Abb 3.12, Seite 69). In einem 2.8%-igem Agarosegel sind die Proben nach dem Restriktionsverdau aufgetrennt worden.
 

2.3.19 Bestimmung des Mikrosatellitenstatus

Zur Untersuchung von Tumorgewebe auf Mikrosatelliteninstabilität wurden die PCR-Produkte der repetitiven Sequenz des Tumor- mit der des Normalgewebes verglichen. Hierzu sind 4 µl der PCR-Produkte mit 8 µl SSCP-Stop-Lösung versetzt und bei 98 °C im Wasserbad für fünf Minuten denaturiert und sofort auf Eis überführt worden. Die Proben wurden zügig auf ein 400 mm x 200 mm x 0.75 mm großes, denaturierendes, 6.7 %-iges Acrylamidgel, das 50% Harnstoff enthält, aufgetragen. An das unbeladene Gel wurde mindestens 30 Minuten vor dem Auftragen der Proben eine Spannung von 1500 V angelegt, um eine gleichmäßige Erwärmung des Gels sicherzustellen. Die Proben wurden daraufhin bei konstanten 1500 V für ungefähr zwei Stunden aufgetrennt. Zur Detektion der Banden wurde das Gel mit Silver Stain Plus gefärbt (BioRad).
 
 

2.4 Probenmaterial

Von folgenden Familienmitgliedern standen Blutproben zur Verfügung, aus welchen DNA isoliert wurde: II.2, II.3, II.4, II.5, III.2, III.3, III.4, III.5, III.7, III.8, III.8. Bei Indexpatientin II.5 ist zusätzlich RNA präpariert worden. Zusätzlich standen in Paraffin gebettete Tumorgewebeproben von Kolonkarzinomen der Probanden II.5 und III.8 zur Verfügung, von zuletzt genannter Person zusätzlich ein Gewebeblock eines in situ Karzinoms der Cervix Uteri.
Als DNA Negativ- oder Normalkontrollen wurden insbesamt 17 Blutproben von Personen verwendet, bei denen kein Verdacht auf einen bestehenden oder durchgemachten malignen Prozeß besteht. Diese wurden mit dem Kürzel NC („normal control") versehen und durchnummeriert. Aus diesen 17 Blutproben wurde in neun Fällen RNA gewonnen und als Negativ- kontrolle eingesetzt, deren cDNA mit dem Kürzel N (normal) versehen wurden. Ergänzend wurden zwei cDNAs aus Normalgewebe des Kolons (N66 und N69) bei der Untersuchung der hMLH1-Spleißvarianten verwendet.
Als Negativkontrolle bei der Untersuchung der Mikrosatelliten ist DNA aus Normalgewebe eines Kolons (NT11) verwendet worden. Als methodische Positivkontrollen wurde die DNA der Prostatakarzinomzellinie DU 145 mit einer definierten Mutation in hMLH1 für die SSCP und T33, eine cDNA von Tumorgewebe eines sporadischen Kolonkarzinoms, mit definierter Mutation im APC Gen, bei dem IVSP-Assay verwendet [20].