Elucidating the Mechanisms of TH17 Cell Stability and Plasticity in Organ-specific Autoimmunity

Abstract

The kidney is an organ with various important functions in the human body. One of those functions among the synthesis of important hormones and the regulation of the water and electrolyte balance is the detoxification via the urine. When these functions are disturbed over a longer period like in the case of glomerulonephritis (GN) diseases, life-threatening effects can occur. Among different forms of GN which go along with inflammation of both kidneys and where the renal corpuscles (glomeruli) are damaged, the GNs with autoimmune-related genesis and especially T helper cells (TH cells) are an important proportion of all kidney diseases. TH cells are, like B cells, an elementary part of the human adaptive immune system. Their names originate from the location in the body where they mature – the thymus. TH cells represent a special class of lymphocytes which can promote B cells in their activation but are also able to mediate inflammatory reactions themselves. The classic subdivision into TH1 and TH2 cells which existed before 2005 was expanded by the discovery of IL-17-producing TH17 cells. These cells are substantially involved in the regulation of inflammatory processes against bacteria and in autoimmune-mediated diseases. One feature of these cells is the ability to transdifferentiate into other cells like TH1 and T-regulatory (Treg) cells. This property known as TH17 plasticity seems to play a major role in the pathogenesis of autoimmune-mediated diseases like Multiple Sclerosis (MS). In a MS mouse model a higher TH17 cell plasticity was found. In contrast, TH17 cells in GN show more stable behavior. In addition, it was found that TH17 cells mediate the course of the GN by recruitment of neutrophils into the renal tissue and therefore are an essential factor in the pathogenesis of this disease. The aim of this work was the elucidation of mechanisms which could explain the high TH17 cell stability in the GN and to find gene targets which are capable to modify the TH17 cell plasticity as a potential therapeutic agent and thereby inhibiting or attenuating the pathogenesis of the GN. In an unbiased experimental approach, different disease models like GN, EAE, a-CD3 duodenitis and infection with Staphylococcus aureus were induced in separated experiments. By RNA bulk sequencing, differential gene expression profiles were analyzed between the different disease models. Models with higher TH17 cell plasticity (like EAE) were compared to the GN model with limited TH17 plasticity. After further data analysis and comparisons, potential target genes which could have an influence on TH17 cell plasticity were identified. As a very interesting molecular candidate the IL-27 receptor a (IL-27ra) was selected. Another aim of this work was the investigation of the IL-27/IL-27ra-axis in the GN. From former studies, it is known that the IL-27/IL-27r-axis can activate both pro- and anti-inflammatory immune-mediated mechanisms depending on the model and experimental circumstances. In order to elucidate the role of this biochemical pathway in the GN, NTN-induced IL-17A reporter mice were treated with IL-27, after validation of our sequencing data by FACS analysis. Here, a strongly reduced pathogenesis in IL-27-treated mice compared to PBS-treated control mice could be verified. Although, in recent experiments a direct influence of IL-27 on the phenotype of TH17 cells could not be found. Afterwards, it was aimed to understand the underlying biochemical pathways behind the reduced GN pathogenesis by IL-27 treatment. Here, the proportion of phospho-STAT3 (pSTAT3) of kidney cells after in vitro stimulation with IL-27 and IL-6 as a positive control was determined and compared to PBS-stimulated control cells. As a result, a moderate increase in the pSTAT3 proportion in IL-6-stimulated cells compared to PBS-treated control cells was found. Although, after IL-27 stimulation, a significant increase in pSTAT3 compared to control cells could not be verified. One reason for this finding might be the general high proportion of pSTAT3, caused by other biochemical pathways. Furthermore, it could be shown in conditional tbx21- (Tbet) knockout mice that this essential transcription factor in TH1 cell has no impact on the NTN-pathogenesis or TH17 cell stability in this model.

Die Niere stellt ein Organ mit vielen wichtigen Funktionen im menschlichen Körper dar. Eine dieser Aufgaben, neben der Synthese wichtiger Hormone und der Regulation des Wasser- und Elektrolythaushalts, ist die Entgiftung über den Urin. Sind diese Funktionen, etwa in Folge von Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritiden (GN), nachhaltig gestört, so kann dies lebensbedrohliche Auswirkungen haben. Neben verschiedenen Formen der GN, welche mit einer beidseitigen Entzündung der Nieren einhergehen und bei denen zunächst die Nierenkörperchen (Glomeruli) geschädigt werden, bilden die GN mit autoimmun-bedingter Genese, und hier speziell der T-Helferzellen (TH-Zellen), einen wichtigen Anteil aller Nierenerkrankungen. TH-Zellen sind, wie auch B-Zellen, ein elementarer Bestandteil des adaptiven Immunsystems des Menschen. Ihren Namen erhielten sie nach dem Ort, in dem sie reifen - dem Thymus. TH-Zellen stellen eine spezielle Klasse von Lymphozyten dar, die B-Zellen die notwenige Unterstützung zur Aktivierung geben können, aber über Zytokine auch selbst direkt Entzündungsreaktionen steuern können. Die klassische Unterteilung in TH1- sowie TH2- Zellen, die bis vor dem Jahr 2005 existierte, wurde durch die Entdeckung von IL-17-produzierenden TH17-Zellen erweitert. TH17-Zellen sind substanziell an der Regulierung von Entzündungsprozessen, bei der Abwehr von Bakterien und in autoimmun-vermittelten Erkrankungen beteiligt. Eine besondere Eigenschaft stellt die Fähigkeit dieser Zellen dar, in andere Zellen (TH-Zellen, T-regulatorische (TReg)-Zellen) zu transdifferenzieren. Diese als TH17-Plastizität bezeichnete Eigenschaft scheint eine wichtige Rolle in der Pathogenese von autoimmune-vermittelten Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS) zu spielen. Bei einem Mausmodell der MS wurde eine erhöhte TH17-Plastizität gefunden. Im Gegensatz dazu sind TH17-Zellen in der GN relativ stabil. Es wurde zudem gefunden, dass TH17-Zellen den Krankheitsverlauf der GN durch die Migration von Neutrophilen in das Nierengewebe vermitteln und so einen entscheidenden Faktor in der Pathogenese dieser Erkrankung darstellen. Das Ziel dieser Arbeit war es, Mechanismen, die diese hohe TH17-Stabilität in der GN begründen, aufzuklären und molekulare Ziele zu identifizieren, die die TH17-Plastizität in der GN modifizieren und so ggf. als therapeutisches Agens dazu genutzt werden können, die Pathogenese der Erkrankung zu hemmen bzw. zu attenuieren. Um dies zu realisieren, wurde ein unvoreingenommener Ansatz (unbiased approach) verfolgt. Dazu wurden in separaten Experimenten verschiedene Krankheitsmodelle (GN, EAE, a-CD3 Duodenitis, Infektion mit Staphylokokkus Aureus) induziert. Anschließend wurden mittels RNA-Sequenzierung differenzielle Genexpressionsmuster analysiert und zwischen den verschiedenen Modellen verglichen. Modelle mit hoher TH17-Plastizität (z.B. EAE) wurden dem GN-Modell mit limitierter TH17-Plastizität gegenübergestellt. Durch weitere Analysen und Vergleiche konnten so potentielle Ziel-Gene identifiziert werden, die möglicherweise Einfluss auf die TH17-Plastizität haben. Als einen sehr interessanten Kandidaten selektierten wir den IL-27-Rezeptor a (IL-27ra). Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der IL-27/IL-27r-Achse in der GN näher zu untersuchen. Aus vorangegangen Studien ist bekannt, dass die IL-27/IL-27r-Achse, je nach Modell und Situation, sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Immunmechanismen aktivieren kann. Um die Rolle dieses biochemischen Signalwegs in der GN zu entschlüsseln, wurden, nach Validierung der Sequenzierungsergebnisse mittels FACS-Analysen, NTN-induzierte IL-17A Reporter-Mäuse mit IL-27 behandelt. Hierbei konnte eine stark verminderte Pathogenität dieser mit IL-27-behandelten Mäuse im Vergleich zu PBS-behandelten Kontrollmäusen nachgewiesen werden. Allerdings konnte in den bisherigen Experimenten kein direkter Einfluss von IL-27 auf den Phänotyp von TH17-Zellen nachgewiesen werden. Anschließend war es das Ziel, die hinter der verminderten GN-Pathogenese durch IL-27 liegenden biochemischen Signalwege zu verstehen. Dazu wurde der Anteil von phospho-STAT3 (pSTAT3) nach in vitro-Stimulation von Nierenzellen mit IL-27 bzw. IL-6 als Positivkontrolle gegen PBS-stimulierte Kontrollzellen ermittelt und miteinander verglichen. Dabei konnte eine leichte Erhöhung des pSTAT3-Anteils bei IL-6-Stimulation gegenüber PBS-Kontrollen, jedoch keine signifikante Erhöhung bei IL-27-Stimulation ermittelt werden, was mit dem allgemein hohen Anteil von pSTAT3 durch andere biochemische Signalwege zu erklären sein könnte. Zudem konnte in weiteren in vivo Experimenten mit konditionalen tbx21-(Tbet) knockout-Mäusen gezeigt werden, dass dieser wichtige Transkriptionsfaktor in TH1-Zellen keinen Einfluss auf die Pathogenität oder die Stabilität von TH17-Zellen im NTN-Modell hat.