Investigation of extracellular vesicles from glioblastoma multiforme and meningioma patients for cancer liquid biopsy by differential quantitative proteomics

Abstract

Although intracranial cancers are typically not among the most common cancers in adults, they encompass one of the deadliest and are the second most common cancers in children. Gliomas account for over 78% of malignant brain tumours, with glioblastoma multiforme (GBM) being the most invasive. Despite notable recent achievements in oncology research, GBM patients have a survival rate between 15 and 23 months and a 5-year survival less than 6%. Meningiomas (MEN) are less invasive but however, make up 36.6% of all primary brain and other CNS tumours and still possess life threatening characteristics. Like other cancers, early and non/minimally invasive diagnosis therefore is vital for better prognosis. The ability of extracellular vesicles (EVs) to transfer molecular cargo and be selectively taken up by specific cells can be exploited in multiple facets of cancer biology. The main goal of this study was therefore to employ SWATH-DIA mass spectrometric technique in identifying potential GBM and MEN EV specific biomarkers for cancer liquid biopsies, hence facilitating early detection and personalised cure. Tumour tissues were obtained from four GBM patients and four MEN patients. Primary cells were cultured from each patient tissue and Extracellular vesicles were spun down from each cell culture supernatant. Firstly, the variable window method for SWATH-DIA was compared to the classic go-to DDA method. SWATH-DIA produced outstanding results and was therefore the method of choice throughout this study. With an average of 2500 to 3000 proteins quantified in every patient tissue and cells, proteins which were quantified in every patient’s tissue, cells and EVs within the various cancer types were further analysed to obtain specific cancer-EV markers. A list of 99 proteins were identified as unique to the MEN samples and therefore postulated as potential MEN EV specific markers. For GBM, 91 proteins were unique to these samples. When compared to existing literature of potential GBM-EV specific proteins, interestingly, 14 GBM-EV specific proteins were identified. Pathway analysis of these 14 proteins indicated that; YWHAQ, YWHAG and THBS1 are associated with the PI3K/Akt signalling pathways which have been reported to be frequently disturbed in many human cancers; VCL, TLN1, IQGAP1, VCP, A2M, F2, ANXA1, THBS1 and LGALS3BP are associated with the biological process of vesicle mediated transport while FLNB, IQGAP1 and THBS1 are categorised as proteoglycans in cancer. These proteins may serve as potential GBM-EV specific markers and are therefore subject to further validation studies. The variation between these tissues and their primary cells was also studied. Primary tumour cells however showed little variation to the original tumours, maintaining many of the important markers. This supports their current stance as a great sample source especially for research in personalised medicine. Differential proteomic studies were also carried out on tumour (GBM and MEN) and non-tumour epileptic (white matter and cortex) brain tissues. This goal was also achieved as lists of aberrantly regulated proteins were generated in each cancer type. Specific proteins involved in tumourigenesis and metastasis were quantified in both cases; and represent panels for further validation. Finally, identified cancer-EV markers which were also significantly dysregulated in tumour tissues were studied. These therefore could be potential tumour markers which can possibly be identified from liquid biopsy hence facilitating early and non/minimally invasive diagnosis of cancers which is vital for better prognosis. This is the first time which this approach is implemented for GBM and MEN EV biomarker discovery and may contribute massively towards research in the field of tumour diagnosis from patient EVs.

Obwohl intrakranielle Krebserkrankungen bei Erwachsenen normalerweise nicht zu den häufigsten Krebserkrankungen gehören, umfassen sie eine der tödlichsten und sind die zweithäufigste Krebserkrankung bei Kindern. Gliomen machen über 78% der malignen Gehirntumoren aus, wobei Glioblastoma Multiforme (GBM) am invasivsten sind. Trotz der bemerkenswerten aktuellen Fortschritte in der Onkologie-Forschung haben GBM-Patienten eine Überlebensrate zwischen 15 bis 23 Monaten und eine 5-Jahres-Überlebenssrate haben unter 6% der Patienten. Meningeome (MEN) sind weniger invasiv, bilden jedoch 36,6% aller primären Hirn- und anderen zentralen Nervensystem- (ZNS) Tumoren und besitzen lebensbedrohliche Eigenschaften. Wie bei anderen Krebserkrankungen ist eine frühzeitige und nicht-/minimalinvasive Diagnose entscheidend für eine bessere Prognose. Die Fähigkeit der extrazellulären Vesikel (EVs), molekulare Ladung zu übertragen und von spezifischen Zellen selektiv aufgenommen zu werden, kann für die Krebs-Diagnostik genutzt werden. Daher war das Hauptziel dieser Studie, EVs nach potenziellen spezifischen Markern der GBM- und MEN-EV zu suchen. Diese Marker könnten zukünftig mittels der flüssigen Krebsbiopsien zur Früherkennung und individuellen Therapie der Patienten beitragen. Tumorgewebe wurden von vier GBM- und vier MEN-Patienten erhalten. Primärzellen wurden aus jedem Patientengewebe kultiviert und extrazelluläre Vesikel aus jedem Zellkultur-Überstand gewonnen. Zunächst wurde die Variabele-Fenster-Methode für SWATH-DIA mit der klassischen DDA-Methode verglichen. SWATH-DIA lieferte hervorragende Ergebnisse und wurde deshalb die Methode der Wahl in dieser Studie. Mit einem Durchschnittswert von 2500 Proteinen in jeder Probe wurden Proteine, die in jedem Patientengewebe, Zellen und EVs der verschiedenen Krebstypen identifiziert und quantifiziert werden konnten, weiter analysiert, um spezifische Krebs-EV-Marker zu erhalten. Eine Liste von 99 Proteinen wurde für die MEN-Proben eindeutig identifiziert und daher als potenzielle MEN-EV-spezifische Maker postuliert. Für GBM waren 91 Proteine für diese Proben spezifisch. 14 potenziellen GBM-EV spezifische Proteine stimmten mit denen in der Literatur überein. Die Pathway-Analyse dieser 14 Proteine zeigte, dass YWHAQ, YWHAG und THBS1 im Zusammenhang mit den PI3K/Akt Signalwegen stehen, von denen berichtet wurde, dass sie bei vielen Krebserkrankungen häufig gestört sind. VCL, TLN1, IQGAP1, VCP, A2M, F2, ANXA1, THBS1 und LGALS3BP sind mit dem biologischen Prozess des durch Vesikel vermittelten Transports assoziiert, während FLNB, IQGAP1 und THBS1 als Proteoglykane eingestuft werden. Diesen Proteinen sind potenzielle GBM-EV spezifische Marker und sollten zukünftig validiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden zudem Krebs-Gewebe und ihre kultivierten Primärzellen untersucht. Primäre Tumorzellen zeigten nur geringe Unterschiede zu den Ursprungstumoren. Dies unterstützt ihre derzeitige Stellung als geeignete Probenquelle für die Forschung in der individuellen Medizin. Als weiterer Punkt wurden differenzielle Proteomik-Studien an Tumoren (GBM und MEN) und Nicht-Tumor-Epileptikum (weiße Substanz und Kortex) im Gehirngewebe ausgeführt. Für jeden Krebstyp wurden Listen von Marker-Proteinen identifiziert. In beiden Fällen wurden Proteine, die an Tumorgenese und Metastase beteiligt sind, quantifiziert und repräsentieren Panels für die weitere Validierung. Anschließend wurden die identifizierten Krebs-EV-Marker, die auch in Tumorgeweben signifikant fehlreguliert waren, identifiziert. Diese könnten daher potenzielle Tumormarker sein, die möglicherweise anhand einer Flüssigkeitsbiopsie identifiziert werden können, wodurch eine frühzeitige und minimale invasive Diagnose von Krebserkrankungen erleichtert wird. Dies ist das erste Mal, dass dieser Ansatz für die Feststellung von GBM- und MEN-EV-Biomarkern eingesetzt wurde.