Native Mass Spectrometry for the Structural Characterization of Membrane-Related Protein Complexes

Abstract

Non-covalent interactions play a lead role in virtually all biological processes. In a living cell, well-working, often dynamic interactions orchestrate a complex variety of cellular pathways and thereby ensure the cell’s healthy state. In order to understand biological processes and potentially prevent or cure diseases, structural studies are performed with a variety of biophysical techniques. Almost three decades after the first pioneering experiments, native mass spectrometry (MS) is still a comparatively new technique that provides insights into stoichiometry, topology and dynamics of interactions. Protein-protein interactions of membranous systems are inherently difficult to characterize in structural studies, as membrane proteins usually require extraction from the protective lipid environment prior to analysis. In this thesis, three protein complexes that interact in different manners with the membrane were studied by native MS.

In a first project, binding of the regulatory protein calmodulin to the plasma membrane Ca2+- ATPase ACA8 from Arabidopsis thaliana was studied. Native MS revealed binding of two calmodulins to the integral membrane protein ACA8.

In the second project, native MS provided novel insights into the formation of membrane- associated protein-phospholipid complexes involved in clathrin-mediated endocytosis. The specific binding of the phospholipids PI(4,5)P2 to single membrane-binding domains (ENTH, ANTH) of clathrin adaptor proteins was investigated. ENTH and ANTH domains from three different species, including Homo sapiens, were demonstrated to assemble to defined complexes with PI(4,5)P2 mediating the interactions. Topology, conformation and assembly dynamics were investigated by native MS and associated structural gas-phase techniques and further complemented with results from other biophysical techniques, e.g. X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), to create a comprehensive image of PI(4,5)P2-dependent assembly of membrane-binding domains of clathrin-adaptor proteins.

The third project exemplifies how studying soluble subcomplexes from large membrane- spanning molecular machines by native MS can produce valuable results on complex composition, topology and assembly pathway. In the present case, the sorting platform of the type III secretion system from Salmonella Typhimurium SPI-1 was investigated. Four different proteins (SpaO, SpaOC, OrgB, InvC) and derived truncated protein constructs were studied by native MS to generate a conclusive picture of protein-protein interactions and further map interacting protein domains. The largest complexes comprising of all four mentioned proteins were further analysed by SAXS and a computational model of the molecular architecture of the complex was generated, respecting the restrictions from native MS data.

Summing up, protein complexes from three different membranous settings were studied in this thesis. Results from these studies clearly illustrate that integral membrane protein complexes are most challenging to study. In contrast, sample handling of membrane- associated proteins is markedly facilitated and native MS further proved to be an excellent tool for the investigation of protein-lipid interactions. Studying soluble subcomplexes of membrane proteins is obviously a drastic simplification of the biological system and allows the usage of experimental procedures as for soluble protein complexes. Here, the obtained data revealed novel insights into complex stoichiometry, topology and assembly pathway, illustrating that the simplification can be worthwhile doing.

Nicht-kovalente Wechselwirkungen spielen bei praktisch allen biologischen Vorgängen eine zentrale Rolle. In einer lebenden Zelle arrangieren diese häufig dynamischen Wechselwirkungen eine komplexe Vielfalt an zellulären Funktionen und sichern damit die Gesundheit und Überlebensfähigkeit der Zelle. Strukturbiologische Analysemethoden ermöglichen Einblicke in derartige biologische Abläufe und können damit letztlich auch zur Erforschung von Krankheiten und der Entwicklung neuer Präventionsmethoden und Therapien beitragen. Obwohl erste Experimente bereits vor knapp drei Jahrzehnten durchgeführt wurden, ist die native Massenspektrometrie (MS) noch eine vergleichsweise neue Methode. Sie ermöglicht es, Erkenntnisse über die Stöchiometrie, Topologie und Dynamik von Interaktionen zu erhalten. Protein-Protein Wechselwirkungen im Umfeld der Membran sind besonders schwierig zu untersuchen, da Membranproteine für die Analyse gewöhnlich aus der schützenden Lipidmembran extrahiert werden müssen. In dieser Arbeit wurden drei Proteinkomplexe, die auf verschiedene Weise mit der Membran in Kontakt stehen, analysiert.

Im ersten Projekt wurde die Bindung des regulatorischen Proteins Calmodulin an die Plasmamembran-Ca2+-ATPase ACA8 von Arabidopsis thaliana untersucht. Dabei konnte die Bindung von zwei Calmodulinen an das integrale Membranprotein ACA8 nachgewiesen werden.

Im zweiten Projekt wurden mittels nativer MS neue Einblicke in die Bildung von membranassoziierten Protein-Phospholipid-Komplexen erlangt, die für die Clathrin- vermittelte Endozytose von Bedeutung sind. Die spezifische Bindung des Phospholipids PI(4,5)P2 an membranbindende Domänen (ENTH, ANTH) von Clathrin-Adapterproteinen wurde untersucht. Es konnte für drei verschiedene Spezies, unter anderem Homo sapiens, gezeigt werden, dass ENTH- und ANTH-Domänen zu definierten Komplexen assemblieren, in denen PI(4,5)P2 die Interaktion zwischen den Proteinen vermittelt. Topologie, Konformation und Assemblierungsdynamik wurden mithilfe von nativer MS und verwandten Gasphasen-Analysemethoden untersucht. Die Daten wurden durch Ergebnisse anderer biophysikalischer Methoden, beispielsweise Röntgenkristallographie oder Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS) weiter ergänzt, um ein aufschlussreiches Abbild der PI(4,5)P2-abhängigen Assemblierung membranbindender Domänen der Clathrin-Adapterproteine zu erhalten.

Im dritten Projekt wurde beispielhaft gezeigt, wie die Untersuchung löslicher Teilkomplexe großer membranverankerter Proteinkomplexe aufschlussreiche Erkenntnisse über den Komplexaufbau, die Topologie und den Assemblierungsweg liefern kann. Im vorliegenden Fall wurde die „Sortierungsplattform“ des Type III Sekretionssystems von Salmonella Typhimurium SPI-1 untersucht. Vier verschiedene Proteine (SpaO, SpaOC, OrgB, InvC) und verkürzte Proteinvarianten wurden mittels nativer MS untersucht, um ein informatives Abbild der Protein-Protein Interaktionen zu erstellen und weiterhin die für die Interaktionen verantwortlichen Domänen zu identifizieren. Der größte Komplex, bestehend aus allen vier genannten Proteinen, wurde zudem in SAXS Experimenten untersucht. Unter Berücksichtigung der Erkenntnisse aus den nativen MS Messungen wurde ferner ein computerbasiertes Modell der molekularen Struktur des Komplexes erstellt.

Zusammenfassend wurden im Zuge dieser Arbeit drei verschiedene Arten von Proteinkomplexen, die mit Membranen in Verbindung stehen, untersucht. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass integrale Membranproteinkomplexe am schwierigsten zu untersuchen sind. Im Vergleich dazu ist die Handhabung von membranassoziierten Komplexen deutlich einfacher, hier erwies sich die native MS auch als geeignete Methode um Protein-Lipid-Wechselwirkungen zu untersuchen. Lösliche Teilkomplexe von membranverankerten Komplexen zu untersuchen ist offensichtlich eine starke Vereinfachung des biologischen Systems, erlaubt es jedoch, experimentelle Techniken wie bei löslichen Proteinkomplexen anzuwenden. Das vorliegende Beispiel veranschaulicht, dass diese Reduktion lohnenswert sein kann, da auf diese Weise neue Einblicke in die Stöchiometrie, Topologie und den Assemblierungsweg des löslichen Teilkomplexes erlangt wurden.