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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-95860
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9586/


Analyse der Rolle des am trans-Golgi lokalisierten Proteins PIST bei der Sortierung von postsynaptischen Membranproteinen

Analysis of the role of the trans-Golgi-localized protein PIST in the sorting of postsynapticmembrane proteins

Klüssendorf, Malte

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SWD-Schlagwörter: Proteintransport , Membranproteine , Zentralnervensystem
Freie Schlagwörter (Deutsch): PIST , PDZ-Domäne , Golgi
Basisklassifikation: 44.90 , 42.63 , 42.15 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kreienkamp, Hans-Jürgen (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.02.2019
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 18.02.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle des am trans-Golgi lokalisierten PDZ Domänenproteins PIST bei der Sortierung von interagierenden Membranproteinen im zentralen Nervensystem (ZNS) analysiert. PIST interagiert über seine PDZ-Domäne und Linker-Region mit einer Vielzahl von Membranproteinen, von denen einige auch in der postsynaptischen Dichte (PSD) exzitatorischer Synapsen angereichert sind. Für diese Untersuchung wurden PIST-defiziente Mäuse sowie kultivierte Rattenneuronen nach PIST knockdown als Modellsysteme etabliert und in Bezug auf die Lokalisierung einiger wichtiger Membranproteine im ZNS untersucht. Die zunächst nur verfügbaren heterozygoten PIST knockout-Mäuse zeigten in Zelloberflächenbiotinylierungs- und Stimulationsexperimenten an Gehirngewebeschnitten, dass PIST einen Einfluss auf die Verfügbarkeit einiger seiner synaptisch-lokalisierten Interaktionspartner (mGluR5, Stargazin) an der Zellmembran hat. Nach dem Knockdown von PIST in kultivierten Rattenneuronen wurde ebenfalls beobachtet, dass die Menge von mGluR5, Neuroligin1 und Neuroligin2 an der Zellmembran reduziert war. Wichtige Signaltransduktionswege sind jedoch in beiden Modellen, mit Ausnahme einer leichten Reduktion der basalen Aktivität von AKT, nicht verändert. Um die Verfügbarkeit von homozygoten PIST knockout-Mäusen zu erhöhen wurde eine konditionale Vorderhirn-spezifische PIST knockout-Linie etabliert. Diese Mauslinie unterscheidet sich, neben der Gewebsspezifität, maßgeblich zu den anderen betrachteten Modellen durch den postnatalen und daher relativ späten Verlust von PIST. Wie in den anderen Modellen hatte der Verlust von PIST in homozygoten knockout-Mäusen dieser Linie keinen Effekt auf die zellulären Proteinmengen der PIST-assoziierten Membranproteine. Außerdem waren auch die Mengen dieser Proteine in der Membranfraktion und in der PSD Fraktion im Vorderhirn nicht verändert. Die Aktivität von Signalwegen im Cortex und im Hippocampus war ebenfalls unverändert. Die Analyse der Mäuse in verschiedenen verhaltensbiologischen Tests ergab bei den meisten analysierten Parametern keine Unterschiede zwischen homozygoten PIST knockout-Mäusen und den Kontrolltieren. Jedoch zeigten die knockout-Mäuse sowohl Defizite im Angst-induzierten Lernen von kontextbezogenen Erinnerungen, als auch in der Fähigkeit, zwischen dem Kontext der Konditionierung und einem neuen Kontext zu unterscheiden. Die hier untersuchten Modellsysteme unterscheiden sich durch den Zeitpunkt des Verlustes von PIST. In keinem Fall förderte PIST, wie in der Literatur vorgeschlagen, den Abbau der assoziierten Rezeptoren. Stattdessen zeigte sich, dass PIST während der Entwicklung von neuronalen Systemen eher einen stabilisierenden Einfluss hat und die Lokalisation einiger interagierender Membranproteine an der Zellmembran fördert. Erfolgt der Verlust von PIST erst später, wenn z. B. die Bildung von Synapsen bereits begonnen hat, werden diese Effekte offensichtlich durch andere Mechanismen kompensiert. Für eine eventuelle Rolle von PIST bei der Bildung von Synapsen spricht die Beobachtung, dass die mRNA- und Proteinmenge von PIST in kultivierten Rattenneuronen durch die Inhibierung von NMDA Rezeptoren erhöht wird. Die Relevanz dieser Regulation von PIST, z. B. bei Prozessen der synaptischen Plastizität, ist jedoch unklar und bedarf weiterer Untersuchungen in einem geeigneten PIST-defizienten System, wie es jetzt durch die konstitutive PIST knockout-Mauslinie zur Verfügung steht.
Kurzfassung auf Englisch: In this work, I investigated the role of the trans-Golgi associated PDZ domain protein PIST in the sorting of interacting membrane proteins in the central nervous system (CNS). PIST interacts via its PDZ domain and linker region with a variety of membrane proteins, some of which are also enriched in the postsynaptic density (PSD) of excitatory synapses. For this study, PIST-deficient mice and cultured rat neurons were established as model systems and investigated to determine the localization of some important membrane proteins in the CNS. Initially, only heterozygous PIST knockout mice were available. In cell surface biotinylation and brain tissue sections stimulation experiments, these animals showed that PIST influences the availability of some of its synaptically localized interaction partners (mGluR5, stargazin) at the cell membrane. Similarly, in cultured rat neurons following PIST knockdown, it was observed that mGluR5, neuroligin1 and neuroligin2 levels are reduced at the cell membrane. However, important signal transduction pathways are not altered in either model, with the exception for a slight reduction in the basal activity of the AKT pathway. To increase the availability of homozygous PIST knockout mice, a conditional forebrain-specific PIST knockout line was established. Besides tissue specificity, this mouse line differs significantly from other models due to the postnatal and therefore relatively late loss of PIST. Similar to the other models, loss of PIST in homozygous PIST knockout mice from this line has no effect on the total protein amount of PIST-associated membrane proteins. Also, the amounts of these proteins in the membrane fraction or the PSD fraction in the forebrain were unaffected. The activity of signaling pathways in the cortex and the hippocampus also remains unchanged. Analysis of the mice by various behavioral tests showed no differences between homozygous PIST knockout mice and control mice for most of the parameters analyzed. However, homozygous PIST knockout mice showed deficits in anxiety-induced learning from contextual memories as well as in the ability to distinguish between the context of the conditioning and a new context. The different models described here differ in the timing of the loss of PIST. I found no indication that PIST leads to the degradation of its associated receptors, as suggested in the literature. PIST rather has a stabilizing effect and promotes the localization of some interacting membrane proteins to the cell membrane. This effect on the regulation of interaction partners occurs primarily during the development of neuronal systems. If the loss of PIST occurs later, e.g. when the formation of synapses has already begun, these effects are apparently compensated by other mechanisms. A possible role of PIST in the formation of synapses is suggested by the observation that the amount of PIST mRNA and protein in cultured rat neurons is increased by inhibiting NMDA receptors. However, the relevance of this regulation of PIST in the context of synaptic plasticity is unclear and requires further investigation in a suitable PIST-deficient system, as is now available with the conventional PIST knockout mouse line.

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