A lab-on-a-chip device for optical mapping of single DNA molecules

Abstract

Diseases such as cancer, HIV/AIDS, and malaria are life-threatening, which make an early, reliable diagnosis and treatment a priority. Novel and quick personalized diagnostics methods, which are based on the patients’ genetics, can help medical examiners to optimize their prescriptions. Miniaturized lab-on-a-chip approaches are ideal candidates for such medical diagnostic tests and preventive healthcare.

In contrast to commercialized industrialized sequencing tools, this technique deals with a reduced amount of data, which is only correlated to the specific regions of the DNA molecules, instead of sequencing the whole genome. The analysis process is significantly accelerated, but can be complemented by standard sequencing of the whole genome.

On-chip optical mapping using sequence-specific barcoding of DNA molecules, and fabrication of ultra-sensitive integrated micro- and nanofluidic devices for a rapid and efficient mutation sequence validation are developed in this thesis. They only require a small reagent sampling volume, are cost-efficient and accessible outside the research labs.

A robust and reliable fabrication technique for nanofluidic devices is developed, which simplifies available sophisticated but slow methods. The nanofluidic devices are fabricated either by electron beam lithography or focused ion beam milling as an imprint mold. This mold replicates all multi-dimensional patterns at once in only two minutes using nanoimprint lithography technique. The imprint process is the only fabrication step, which is repeated every time, prior to the DNA preparation and analysis.

A method for barcoding kaposi's sarcoma-associated herpesvirus molecules at specific sequences, and characterizing their optical maps in real time is developed. A competitive binding between netropsin and intercalating dyes on λ-DNA is also presented. The characterization technique is based on direct visualization of real time translocation events of individual barcoded-DNA molecules. The DNA molecules are physically confined in the nanochannels of integrated micro- and nanofluidic devices, and the linearized molecules are imaged by a point laser in an epifluorescence microscopy workstation. The emission signal is collected in a high-efficiency single photon avalanche detector and analyzed by custom-made software to create optical maps of single DNA molecules. The proposed method might pave the way to the future lab-on-a-chip detection of cancer cells with minimum concentration at early stages of the disease.

Krankheiten wie Krebs, HIV/AIDS und Malaria sind lebensbedrohlich und erfordern eine frühzeitige, zuverlässige Diagnose und Behandlung. Neuartige, schnelle Diagnosemethoden können Mediziner bei der Therapie unterstützen, die auf das Genom des Patienten zugeschnitten sein sollte. Miniaturisierte Lab-on-a-Chip Methoden sind ideale Kandidaten für verschiedene medizinische Diagnosetests und Gesundheitsvorsorge.

Im Gegensatz zu kommerziellen, industriellen Sequenzierungswerkzeugen ist bei dieser Technologie der Datenumfang begrenzt, da statt des gesamten Genoms nur die signifikanten Teile des DNA-Moleküls berücksichtigt werden. Es ist daher möglich eine schnelle Teilanalyse zu erhalten, die im Anschluss durch die Sequenzierung des gesamten Genoms ergänzt werden kann.

In dieser Arbeit wird eine Herstellungsmethode für ultraempfindliche integrierte Mikro- und Nanofluidik-Chips zur schnellen und effizienten Validierung von Mutationssequenzen sowie ein optisches Mapping auf dem Chip unter Verwendung von sequenzspezifischer Barcodierung von DNA-Molekülen entwickelt. Diese Geräte benötigen nur ein winziges Testvolumen, und sind kostengünstig herzustellen.

Die hier entwickelte Präparationsmethode für nanofluidische Bauelemente ist robust und zuverlässig und vereinfacht bereits existierende, langsame Methoden. Die nanofluidischen Bauelemente werden entweder durch Elektronenstrahllithographie oder fokussiertes Ionenstrahlätzen in einer Prägeform hergestellt. Diese Form reproduziert alle mehrdimensionalen Muster innerhalb von zwei Minuten mittels der Nanoimprint-Lithographietechnik in diesem Schritt. Für die eigentliche DNA-Analyse können daher leicht weitere Geräte geschaffen werden.

Es wird eine Methode entwickelt, mit der Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus-Moleküle an bestimmten Sequenzen barcodiert und deren optische Abbildungen in Echtzeit charakterisiert werden können. Eine kompetitive Bindung zwischen Netropsin und interkalierenden Farbstoffen an λ-DNA wird ebenfalls vorgestellt. Die DNA-Moleküle sind physikalisch in den Nanokanälen integrierter Mikro- und Nanofluidikvorrichtungen eingeschlossen. Die vorgestellte Charakterisierungstechnik basiert auf der Echtzeit-Visualisierung von Translokationsereignissen einzelner barcodierter DNA-Moleküle. Die linearisierten Moleküle werden mit einem Punktlichtlaser in einer Epifluoreszenz-Mikroskopiearbeitsstation abgebildet. Das Emissionssignal wird durch einen hocheffizienten Einzelphotonen-Avalanche-Detektor erfasst und mit einer maßgeschneiderten Software analysiert, um optische Karten einzelner DNA-Moleküle zu erstellen.

Die vorgeschlagene Methode könnte den Weg für die zukünftige Erkennung von Krebszellen mit minimaler Konzentration im Frühstadium der Erkrankung durch Lab-on-a-Chip Analyse ebnen.