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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-96641
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9664/


Funktion der Mikrotubuli-modulierenden Aktivität von DIAPH2 beim Chromosomen-Alignment

Grüb, Saskia Sybille

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Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Windhorst, Sabine (PD. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.03.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 04.04.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Die Forminfamilie DIAPH (Drosophila-homolog von Diaphanous) besteht aus drei Isoformen. Alle drei DIAPH-Isoformen nukleieren Aktin und stabilisieren Mikrotubuli (MTs), verknüpfen also beide zytoskeletale Strukturen. DIAPH1 wurde bereits charakterisiert und beschrieben, dass es das metastatische Potential von kolorektalen Karzinomzellen durch die Stabilisierung von MTs fördert. Bisher ist bekannt, dass die Bindung von DIAPH-Proteinen an MTs über die FH2-Domänen erfolgt.
In dieser Arbeit wurde die Rolle der Isoform DIAPH2 für die Teilung von Kolonkarzinom-Zellen untersucht. Eine stabile Depletion der DIAPH2 Expression in HT29-Zellen hatte ein fehlerhaftes Chromosomen-Alignment und eine reduzierte Geschwindigkeit der Chromosomen-Separation während der Mitose zufolge. Dadurch bedingt war die Proliferationsrate, das Potential aus Einzelzellen Kolonien zu bilden sowie die Migration in DIAPH2-depletierten HT29-Zellen verringert. Mechanistische Untersuchungen zeigten, dass DIAPH2 diffus im Zytosol von Interphase-Zellen lokalisiert ist, aber in der Metaphase eine eindeutige Kolokalisation mit Spindel-MTs aufweist. Die DIAPH2-Depletion sowie dessen Stimulation durch Cdc42 veränderte die Dynamik der Spindel-MTs signifikant. Dies beweist, dass ein ausgewogenes Gleichgewicht an DIAPH2-Aktivität notwendig ist, um die Spindel-MT-Dynamik präzise zu regulieren. Zellfreie in vitro-Analysen zeigten, dass bakteriell produziertes DIAPH2-VL-Protein die MT-Dynamik sogar ohne die Aktivierung durch Cdc42 beeinflusst. Das DIAPH2-VL-Protein steigerte die MT-Polymerisierung im Vergleich zur DIAPH2-FH2-Domäne um das 10-fache. Unerwarteterweise erhöhte eine DIAPH2-Mutante mit deletierter FH2-Domäne (DIAPH2-ΔFH2) die MT-Polymerisierung ähnlich stark wie die DIAPH2-FH2-Domäne. Dies beweist, dass neben der bereits bekannten FH2-Domäne noch eine weitere MT-binde-Domäne im DIAPH2-Molekül vorhanden ist. Des Weiteren verändern das DIAPH2-VL-Protein und die DIAPH2-FH2-Domäne die Dichte von Taxol-stabilisierten MTs. Die ΔFH2-Mutante hatte jedoch keinen Effekt auf die MT-Struktur. Die FH2-Domäne und eine weitere DIAPH2-Domäne scheinen daher die MT-Dynamik über verschiedene Mechanismen zu vermitteln. Zusammengefasst zeigen die in dieser Arbeit gewonnenen Daten, dass DIAPH2 Cdc42-stimulations-unabhängig die Mitose-Progression durch die Regulation der Spindel-MTs kontrolliert. Zusätzlich zur bereits bekannten MT-bindenden FH2-Domäne konnte gezeigt werden, dass eine weitere Domäne von DIAPH2 für die Kontrolle der MT-Dynamik benötigt wird.
Kurzfassung auf Englisch: The protein family of DIAPH (Drosophila homologue of Diaphanous) formins is comprised of three isoforms. They are all known to nucleate actin and stabilize microtubules (MTs) and can serve as a link between both cytoskeleton structures. DIAPH1 has already been shown to promote the metastatic potential of colorectal carcinoma cells by stabilizing microtubules. It had been shown that DIAPH-proteins bind MTs via their FH2 domain.
In this thesis, the role of the isoform DIAPH2 for division of colon carcinoma cells was
investigated. It was found that stable depletion of DIAPH2 expression in HT29 colon cancer cells led to a defective chromosomal alignment and reduced the speed of chromosomal separation during mitosis. Furthermore, DIAPH2 knock down cells exhibited a reduced proliferation rate, a decreased potential of single cells to form colonies and a weakened invasiveness into a scratch wound. Localization studies showed that DIAPH2 was diffusely localized in the cytosol of interphase cells. In metaphase cells, however, the protein demonstrated a clear co-localization with spindle microtubules. DIAPH2 depletion as well as stimulation of DIAPH2 by Cdc42 significantly altered the dynamics of spindle MTs. These results indicate the necessity of a tightly balanced DIAPH2 activity to control spindle MT-dynamics. In vitro, cell free analysis revealed that recombinantly expressed full-length (VL)-DIAPH2 strongly influenced MT-dynamics. Even without Cdc42-mediated stimulation, DIAPH2-VL protein increased MT polymerization 10-fold compared to the DIAPH2-FH2 domain. Interestingly, a DIAPH2 mutant lacking the FH2 domain (DIAPH2-ΔFH2), revealed an increased MT polymerization, comparable to the activity of the DIAPH2-FH2 domain. This demonstrates, that in addition to the already characterized FH2 domain, a further MT-binding domain is present in the DIAPH2 molecule. Additionally, the DIAPH2-VL protein and the DIAPH2-FH2 domain altered the density of taxol-stabilized MTs, which was not the case for the ΔFH2 mutant of DIAPH2. The FH2 domain and another DIAPH2 domain thus seemed to mediate MT dynamics via different not yet clearified mechanisms. Concluding, the data obtained in this study indicate that DIAPH2 controls mitosis progression independently of stimulation, by regulating the stability of spindle MT. Furthermore this work provides evidence for an additional MT-binding domain in the DIAPH2 protein that regulates MT dynamics by a different mechanism than the already characterized FH2 domain.

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