Etablierung eines Modells zur Charakterisierung epigenetischer Aspekte der kardialen Hypertrophie im künstlichen Herzgewebe

Abstract

Die Herzinsuffizienz stellt eine der häufigsten Todesursachen in den westlichen Industrienationen dar. Mit derzeitig verfügbaren Therapieoptionen kann eine Verbesserung des funktionellen Status des Herzens sowie eine Verminderung der Symptomenlast erzielt werden und die Mortalität gesenkt werden. Die Herzinsuffizienz mit hochgradig reduzierter linksventrikulärer Ejektionsfraktion geht jedoch weiterhin mit einer sehr schlechten Prognose einher. Das heterogene Feld der Epigenetik ist in den letzten Jahren zunehmend in den Fokus wissenschaftlicher Aufmerksamkeit gelangt, und in verschiedenen medizinischen Bereichen konnten der Einfluss epigenetischer Regulationsmechanismen in Zelldifferenzierung, -homöostase sowie Pathogenese entschlüsselt und therapeutischen Optionen zugänglich gemacht werden. Währenddessen mangelte es lange an Forschungsarbeit zur Rolle der Epigenetik in der Pathogenese kardiovaskulären Erkrankungen. Unsere Bestrebung war es somit, den Einfluss epigenetischer Regulationsmechanismen, speziell den der DNA-Promotormethylierung, in der Pathogenese der kardialen Hypertrophie, welche einen wesentlichen Risikofaktor für die Entstehung der Herzinsuffizienz darstellt, zu beleuchten. Hierzu wurden künstliche Herzgewebe (EHTs) im 24-Well-Format nach bereits etabliertem Protokoll nach 14-tägiger Zellkultur und unter Tierserum-freien Bedingungen entweder einer akuten Nachlasterhöhung oder der Stimulation mit dem α1-Rezeptoragonisten Phenylephrin ausgesetzt und anschließend Effekte auf transkriptioneller Ebene sowie auf die DNA-Methylierung in Promotorbereichen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen untersucht. Hierzu verwendeten wir zunächst eine durch uns etablierte Methodik zur Quantifizierung methylierter DNA mittels quantitativer PCR sowie einen genomweiten Methylierungs-Array. Wesentliche Ergebnisse der Arbeit sind im Folgenden kurz dargestellt: • Die von uns etablierte Methode zur Quantifizierung der DNA-Methylierung mittels quantitativer PCR kann ausreichend zwischen methylierter und nicht methylierter DNA unterscheiden. • Bei der DNA-Methylierung handelt es sich auch in differenzierten Kardiomyozyten um einen dynamischen Prozess. • Das verwendete in vitro-Modell der kardialen Hypertrophie ist zur Untersuchung epigenetischer Merkmale in Kardiomyozyten und im Folgenden auch zur Testung von Substanzen mit epigenetischem Wirkpotential geeignet. • Charakteristische Veränderungen in der Transkriptionsregulation von Kardiomyozyten nach Hypertrophie-Induktion gehen mit einer differenziellen Methylierung einzelner Promotorbereiche einher, welche teilweise eine inverse Korrelation mit der Expression des jeweiligen Gens aufweisen. Diese Veränderungen sind größtenteils unabhängig vom jeweiligen Stimulus und offenbar vielmehr ein gemeinsames Charakteristikum der pathologischen kardialen Hypertrophie. Anhand dieser Erkenntnisse ist es nun möglich, mit Hilfe eines relativ einfachen Modells der kardialen Hypertrophie unter Monitoring des Kontraktilitätsverhaltens der Kardiomyozyten und unter weitest gehendem Ausschluss unkontrollierbarer Störfaktoren epigenetische Mechanismen und Substanzeffekte zu testen.

Congestive heart failure still represents one of the main causes of death in Germany. Therapeutic options may improve the functional status of the heart and decrease mortality and impairment by symptoms such as dyspnea, but still there are no causal therapeutic options available and progressive heart failure remains associated with a very poor prognosis. The emerging field of epigenetics shed light on the influences of mechanisms such as DNA methylation and histone modification in cell differentiation, homeostasis and pathogenesis and made them accessible as a target for novel therapeutic strategies. Whilst first epigenetic drugs are approved for human use in the field of oncology, the role of DNA methylation in heart failure remained unclear. Our aim was to investigate the influence of epigenetic mechanisms, DNA methylation in particular, in the pathogenesis of cardiac hypertrophy, which is a main risk factor for the development of congestive heart failure. Therefore we used engineered heart tissue (EHT) in a 24-well-formate in conjunction with a well-established protocol of hypertrophy-induction. After 14 days of cell culture EHTs were either exposed to an acute increase in afterload or to pharmacological stimulation by the α1-receptor agonist phenylephrine. We then analysed changes in gene expression as well as effects on promoter methylation in quantitative real time PCR and with a genome wide promoter methylation array. To this end we needed to establish a method for enrichment of methylated DNA-fragments. Main results of this work were the following: • The newly established method for quantification of methylated DNA in real time PCR does sufficiently differentiate between methylated and non-methylated DNA-fragments. • DNA-methylation appears to be a dynamic process even in terminally differentiated cardiac myocytes. • Accordingly, the in vitro model of cardiac hypertrophy is well suited for the investigation of epigenetic features associated with pathological hypertrophy and may as well be utilized for testing of potential epigenetic drugs. • Characteristic changes in gene transcription in hypertrophic cardiac myocytes are accompanied by differential methylation of the promoter region of the corresponding gene, and partly show an inverse correlation with the latter. • The observed changes in the methylation patterns appeared mainly independent of the underlying hypertrophic stimulus and rather seem to be a common feature of cardiac hypertrophy. We are thus able to investigate epigenetic mechanisms of DNA regulation and potential epigenetic drugs in cardiac tissue in a simple model of cardiac hypertrophy largely avoiding inadvertent influencing factors.