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Titel: Untersuchung der ATP induzierten zytosolischen Calciumoszillationen in humanen umbilikalen Endothelzellen
Sprache: Deutsch
Autor*in: de Mooy, Jonas
Schlagwörter: SOCE; endotheliale Permeabilität; in-vitro Calciumimaging; Store-operated Calcium Entry; endothelial permeability; ATP
GND-Schlagwörter: CalciumGND
ATP
Endothel
FluoreszenzmikroskopieGND
Lunge
Erscheinungsdatum: 2018
Tag der mündlichen Prüfung: 2019-04-08
Zusammenfassung: 
In dieser Arbeit wurden mittels in vitro-Calciumimaging unter Zuhilfenahme eines
Fluoreszenzmikroskops neuartige Calciumoszillationen in HUVEC nach ATP-Stimulation
beobachtet. Die Calciumoszillationen wurden auf verantwortliche Calciumspeicher,
Calciumkanäle und Purinrezeptoren hin analysiert. Zusätzlich wurden das initiale
Calciumsignal charakterisiert und die Aktivität des SOCE nach ATP-Stimulation untersucht. Schließlich wurde ein möglicher Zusammenhang zwischen den Calciumoszillationen und der Regulation der endothelialen Barriere untersucht.
Die Charakterisierung des initialen Calciumsignals bestätigt die Erkenntnisse aus der
Literatur, dass ATP eine Signalkaskade über die G-Protein-gekoppelten-Purinrezeptoren
P2Y1, P2Y2, P2Y11 und die IP3-Kaskade auslösen kann. Die folgende Entleerung der ERCalciumspeicher generiert nahezu vollständig das initiale Signal. Des Weiteren exprimieren die HUVEC die Liganden-aktivierten Calcium-Ionenkanäle P2X4 und P2X7 auf mRNA-Ebene. P2X7 war im Western Blot nicht nachweisbar. Eine Rolle bezüglich des initialen Calciumsignals konnte für beide nicht gezeigt werden.
Der SOCE im Anschluss an die ER-Speicherentleerung ist sowohl in Einzelzellen als auch in Monolayer-Zellverbänden gleichermaßen stark. Der SOCE zeigt sich in HUVEC sensibel auf 2- APB und BTP-2, jedoch nicht auf SKF-96365. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der SOCE in Endothelzellen stark vom STIM1/Orai1-Komplex abhängt.
Die Calciumoszillationen sind von extrazellulärem Calcium abhängig, da BAPTA jene
inhibierte. Zusätzlich reagierten die Calciumoszillationen sensibel auf den SOCE- und IP3- Inhibitor 2-APB mit einer niedrigeren Frequenz. Interessanterweise traten die Oszillationen nur in konfluenten Monolayer und nicht in Einzelzellen ohne Zell-Zell-Kontakte auf. BTP-2 und SKF-96365 waren nicht in der Lage, die Oszillationsfrequenz zu verringern. Als Nebenbefund in der Analyse der Purinrezeptoren zeigte sich, dass die Oszillationen nur nach Stimulation mit dem P2Y2-Agonisten UTP und dem P2Y11-Agonisten BzATP, nicht aber mit dem P2Y1-Agonisten ADP auftraten.
Eine klare Aussage über die zugrundeliegenden Mechanismen der Oszillationen ist nicht
möglich. Es sind aber mehrere Möglichkeiten, wie ein interzelluläres Zusammenspiel
zwischen ER, IP3R, SOCE-Kanälen, Mitochondrien und Calcium-bindenden Proteinen
denkbar. Die SOCE Kanäle sind wahrscheinlich wichtig für die Aufrechterhaltung der
Oszillationen. Die Frage, ob sie sich aktiv-regulatorisch an der Generierung beteiligen oder lediglich zum Auffüllen der ER-Speicher gebraucht werden, kann nicht abschließend geklärt werden. Im in vitro Transwell Flux Assay führt ATP zu einem verminderten parazellulären tracer flux. Das Ergebnis stützt die Theorie, dass das von Erythrozyten und Endothelzellen bei Hochdruckverhältnissen ausgeschüttete ATP eine Ödem-protektive Funktion erfüllt. Die beobachteten Calciumoszillationen scheinen in vitro keine Auswirkungen auf den Barriereverstärkenden Effekt von ATP haben. Zur Rolle der Calciumoszillationen als Effektor kann keine abschließende Aussage gemacht werden und lässt Raum für weitere Untersuchungen zur pysiologischen Funktion.

In this dissertation we observed via in vitro calcium imaging technique cytosolic calcium
oscillations in HUVEC in response to ATP stimulation. We investigated the responsible
calcium-store, channels and purin-receptors. Additionally, we characterized the initial
calcium-signal and looked into SOCE activity following ATP stimulation. Finally, we
investigated a presumed connection between the observed calcium oscillations and the
regulation of the endothelial barrier.
The characterization of the initial signal confirmed the findings in the literature. ATP starts a signaling process via the g-linked-protein-receptors P2Y1, P2Y2, P2Y11 and the IP3 cascade. The following depletion of the ER calcium store contributes by a vast majority to the initial signal. As well HUVEC show the expression of ligand-activated calcium-ion-channels P2X4 and P2X7 on mRNA level. We failed to confirm the results in western blot relating to P2X7. P2X4 and P2X7 played no part regarding the cytosolic calcium levels in our findings. The SOCE activity is of comparable strength in single cells and monolayer. We could show a suppressed SOCE activity in reaction to preincubation with 2-APB and BTP-2, but not with SKF-95365. As a conclusion we postulated a strong dependence of SOCE in HUVEC to the STIM1/Orai1 complex.
The calcium oscillations showed clear dependence to extracellular calcium. Further, the
frequency of the oscillations declined in response to the SOCE and IP3 inhibitor 2-APB. Most intriguingly the oscillations only occurred in HUVEC monolayer, but not in HUVEC single cells. In additional findings BTP-2 und SKF-96365 were not able to lower the oscillation frequency. Further we observed oscillations only after stimulation with P2Y2 agonist UTP and P211 agonist BzATP, but not after stimulation with the P2Y1 agonist ADP. We are currently not able to form a valid conclusion regarding the mechanisms of the oscillations. One can think of multiple possibilities. For example, an intercellular interplay between ER, IP3R, SOCE channels, mitochondria and calcium-binding proteins seems possible. We have strong indication, that SOCE channels are important, but cannot say, if they are involved as a regulatory player or simply needed for re-stocking the ER-calcium-store. Regarding the in vitro transwell flux assay we could show a lower paracellular tracer flux in reaction to ATP stimulation. This fits perfectly with the theory, that when released during high-pressure ATP from erythrocytes and endothelial cells fulfils an edema preventing function. In our data the calcium oscillations appear not to play a significant role within the regulation of barrier function. The physiological role of the calcium oscillations remains yet unclear to us, but opens up the opportunity for further research regarding its physiological role.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8131
URN: urn:nbn:de:gbv:18-96985
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Kiefmann, Rainer (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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