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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-97026
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9702/


Improvement of Protein Crystal Diffraction Using Post-Crystallization Methods : Infrared Laser Radiation Controls Crystal Order

Verbesserung der Röntgenstrahlenstreuung durch Proteinkristalle mittels post-Kristallisationsmethoden : Bestrahlung durch einen Infrarot-Laser kontrolliert die Kristallordnung

Ross Díaz, Breyan Helmuth

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Freie Schlagwörter (Englisch): X-ray diffraction , DPP8 , DPP9 , Diffraction improvement
Basisklassifikation: 33.60 , 42.12 , 35.79
Institut: Physik
DDC-Sachgruppe: Physik
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Chapman, Henry (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.04.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 29.04.2019
Kurzfassung auf Englisch: Protein crystal diffraction is intimately related to crystal order. Thus, the more ordered the crystal the better it diffracts. This feature is fundamental to solve the molecular structure of macromolecules, used by scientists to reveal functions of proteins and ultimately to treat diseases. However, protein crystals are hard to obtain, and most importantly, they often do not diffract sufficiently to provide relevant structural data. This challenging scenario lays the basis of this project, which aims at improving protein crystal order by means of post-crystallization techniques.
Protein crystals consist of two major components, protein and water. The equilibrium between these components is a hallmark of this study. To control crystal order, intra-crystalline water, which is mostly in an amorphous state, can be restructured without affecting protein conformation, by either dehydration, annealing or water exchange. The new crystal state, or phase, might present improved diffraction. The Free Mounting Laser System (FML) is an experimental setup which targets almost exclusively intra-crystalline water to induce higher crystal order. Therefore, it is proposed as a new non-contact method able to successfully improve diffraction quality of protein crystals.
In the present study infrared radiation was focused on protein crystals by FML to increase their temperature, thereby dehydrating them, inducing annealing, or exchanging water by stabilizer chemicals. The establishment of these methods allowed us to understand the responses of diverse model crystal systems to IR radiation. They offer significant advantages over previous systems, mostly related to speed of dehydration and mild non-contact crystal treatments. Moreover, the application of these techniques made it possible to solve the crystallographic structure of two new drug targets, the dipeptidyl peptidases 8 (DPP8) and 9 (DPP9). A detailed analysis of their molecular structure revealed a new binding mechanism, different from the related family member DPP4. DPP8 and DPP9 undergo a disorder-order transition of a 26 aa segment (R-segment). This segment has an arginine, which is responsible for substrate binding. The disordered “open” conformation is suggested to be the interaction target of SUMO1 protein. This non-covalent interaction could be disturbed by DPP8/9 inhibitors in biochemical and biophysical assays. We therefore propose this interaction to be a key checkpoint with physiological relevance in immune response and cancer.
Altogether, this study highlights the relevance of innovative protein crystallography methods. The development of new techniques is quintessential to contribute for future structural contributions to drug development and discovery of new drug targets.
Kurzfassung auf Deutsch: Röntgenstrahlenstreuung durch Proteinkristalle ist direkt abhängig von der Kristallordnung. Je höher der Ordnungsgrad, desto definierter das Streuungsbild. Dieses ist fundamental für die Bestimmung der Molekularstruktur von Makromolekülen, die von Wissenschaftern benutzt wird um die Funktion eines Proteins zu verstehen und letztendlich damit Krankheiten behandelbar zu machen. Allerdings sind Proteinkristalle oft schwierig herzustellen, und wenn vorhanden, ist ihre Streuung oft nicht ausreichend um Rückschlüsse auf die Struktur ziehen zu können. Diese Herausforderungen sind die Basis dieses Forschungsprojekts, das darauf abzielt, Proteinkristallordnung durch post-Kristallisationsmethoden zu verbessern.
Proteinkristalle setzen sich aus den zwei Hauptkomponenten Protein und Wasser zusammen. Das Gleichgewicht dieser beiden ist der Schlüssel dieses Projekts. Um die Kristallordnung zu beeinflussen, kann intra-kristallines Wasser, das großteils in einem amorphen Zustand ist, durch Dehydrierung, Temperung oder Wasseraustausch umstrukturiert werden, ohne dass die Proteinfaltung davon verändert wird. Der neue Kristallzustand beugt die Röntgenstrahlen potentiell besser. Das Free Mounting Laser System (FML) ist ein experimenteller Aufbau, der vorrangig dazu dient, über das intra-kristalline Wasser eine höhere Kristallordnung zu induzieren. Es wird daher als neue kontaktfreie Methode vorgeschlagen, um die Streuungsqualität von Proteinkristallen erfolgreich zu verbessern.
In der vorliegenden Arbeit wurde Infrarot (IR)-Strahlung mittels FML auf Proteinkristalle fokussiert, um ihre Temperatur zu erhöhen. Dadurch wurden sie dehydriert, getempert, oder Wasser gegen stabilisierende Chemikalien ausgetauscht. Mit diesen Methoden untersuchten wir die Reaktion von verschiedenen Modellkristallsystemen auf IR-Strahlung. Wir fanden signifikante Vorteile gegenüber bestehenden Behandlungsmethoden, insbesondere die Geschwindigkeit der Dehydrierung sowie die sanfte kontaktlose Kristallbehandlung. Darüber hinaus haben erst diese Methoden ermöglicht, die Kristallstruktur von zwei neuen pharmazeutisch interessanten Proteinen, den Dipeptidylpeptidasen 8 (DPP8) und 9 (DPP9), zu lösen. Die detaillierte Analyse ihrer Molekularstruktur enthüllte einen bisher unbekannten Bindemechanismus für Liganden, abweichend vom besser charakterisierten Familienmitglied DPP4. In DPP8 und DPP9 kommt es zu einem ungeordnet-geordnet Übergang eines 26 Aminosäuren langen Abschnitts (R-segment). In diesem Abschnitt liegt ein für die Substratbindung verantwortliches Arginin. Es liegt nahe, dass die ungeordnete, "offene", Konformation die Bindungsstelle für das Protein SUMO1 ist. Diese nicht-kovalente Interaktion konnte durch DPP8/9 Inhibitoren in biochemischen und biophysikalischen Experimenten unterbunden werden. Wir verstehen diese Interaktion deshalb als Schlüsselstelle mit physiologischer Relevanz im Immunsystem und bei Krebs Erkrankungen.
Zusammenfassend wird durch diese Arbeit die Relevanz von innovativen Methoden in der Proteinkristallographie belegt. Die Entwicklung von neuen Methoden ist unabdingbar, damit Strukturanalysen auch in Zukunft zur Entdeckung neuer pharmazeutischer Ziele und der Entwicklung neuer Medikamente beitragen können.

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