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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-97351
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9735/


Genome-wide ribosome profiling reveals a translational enhancer function for TDP-43 in cellular models of neurodegenerative disease

Genomweites Ribosome Profiling enthüllt eine translationale Verstärkerfunktion von TDP-43 in zellulären Modellen neurodegenerativer Erkrankungen

Neelagandan, Nagammal

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SWD-Schlagwörter: RNA-Bindeproteins , TDP-43 , Translationskontrolle , Neurodegenerativen Erkrankungen , Ribosome Profiling
Freie Schlagwörter (Englisch): RNA-binding protein , TDP-43 , Translational control , Neurodegenerative diseases , Ribosome profiling
Basisklassifikation: 42.13 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Duncan, Kent (Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.04.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 23.05.2019
Kurzfassung auf Englisch: Altered function of the RNA-binding protein Transactive Response (TAR) DNABinding Protein 43 (TDP-43) is implicated in the neurodegenerative diseases frontotemporal dementia (FTD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). TDP-43 mutations are detected in many patients and the protein is one of the major components of the ubiquitinated inclusions that are characteristic pathological features of these diseases. During disease, the level of cytoplasmic TDP-43 is significantly increased in diseased neurons. This increase in cytoplasmic TDP-43 levels suggests a potentially important role in this cellular compartment. In spite of significant research, it remains unclear how altered TDP-43 function causes disease. Cell and animal models support a key role in disease for altered regulation of cellular RNAs in motor neurons by TDP-43, including effects on transcription, splicing and stability.
Proteomic studies have revealed that TDP-43 interacts with many cytoplasmic proteins almost all of which are involved in translation. Intriguingly, many of these interacting proteins are also found in stress granules, dynamic cellular ribonucleoprotein structures believed to be important for translational control. Recent work has also implicated TDP-43 in transport of mRNAs in neurons, a process that is typically linked to translational control. To date, only a handful of TDP-43 translational targets have been identified. Taken together, these observations support the idea that TDP-43 might regulate translation in the cytoplasm in healthy neurons and that altered translational control by TDP-43 could contribute to disease. However, there is little evidence for this idea to date. Although previous studies have revealed TDP-43’s direct RNA targets and function in many aspects of mRNA metabolism, it remains unresolved which effects on gene expression are the key drivers of disease.
Here, I used ribosome profiling of motor neuron cell lines and primary cortical neurons to identify mRNAs whose translation is altered by a TDP-43 patient mutant protein. This revealed a subset of translational target mRNAs for mutant TDP-43, including some affected in both cell types. I validated increased ribosome density by polysome profiling in Camta1, Mig12 and Dennd4a mRNAs and demonstrated that these are direct TDP-43 binding targets by UV crosslink-IP. Camta1 and Dennd4a mRNAs encode proteins directly linked to ALS and other neurodegenerative diseases. Interestingly, I found that the impact of altered mRNA translation on levels of the encoded protein can be cell-type and cell-compartment specific. Furthermore, using dual luciferase assays, I have defined the mRNA regions which mediate this positive translational regulation by TDP-43. The 5’UTR was important for Camta1 and Mig12 mRNAs and 3’UTR for Dennd4a mRNA. These results reveal a previously unappreciated role for TDP-43 as an mRNA-specific translational enhancer and suggest that this function contributes to disease.
Kurzfassung auf Deutsch: Eine veränderte Funktion des RNA-Bindeproteins Transactive Response (TAR) DNABinding Protein 43 (TDP43) steht in Verbindung zu den neurodegenerativen Erkrankungen Frontotemporale Demenz (FTG) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Mutationen in TDP-43 wurden bisher in vielen Patienten gefunden, und das Protein ist als eine der Hauptkomponenten der, für die oben genannten Krankheiten charakteristischen, ubiquitinierten Einschlüsse bekannt. Im Krankheitverlauf steigt in erkrankten Neuronen der Spiegel an zytoplasmatischem TDP-43 signifikant an und spricht für eine möglicherweise wichtige Rolle von TDP-43 in diesem zellulären Kompartiment. Trotz erheblichem Forschungsaufwand ist weiterhin unklar, wie die veränderte Funktion von TDP-43 zur Ausbildung von Krankheiten beiträgt. Zellkulturund Tiermodelle unterstützen die These, dass TDP-43 eine Schlüsselrolle in der veränderten Regulation (einschließlich Transkription, Splicing und Stabilität) zellulärer mRNAs in Motoneuronen einnimmt.
Proteomische Studien haben gezeigt, dass TDP-43 mit vielen zytoplasmatischen Proteinen interagiert, die größtenteils am Prozess der Translation beteiligt sind. Verblüffenderweise finden sich viele dieser Proteine auch in Stress Granules, dynamischen, zellulären Ribonukleoproteinstrukturen, denen man eine wichtige Rolle in der Translationskontrolle zuschreibt. Jüngste Arbeiten haben TDP-43 auch mit dem Transport von mRNAs in Neuronen in Verbindung gebracht, einem Prozess, der typischerweise ebenfalls in Zusammenhang mit Translationkontrolle gebracht wird. Nur wenige validierte Zielproteine von TDP-43 konnten bisher identifiziert werden. Zusammengefaßt läßt sich aufgrund der genannten Beobachtungen feststellen, dass TDP-43 möglicherweise als Translationsregulator im Zytoplasma gesunder Neuronen wirkt und durch veränderte Kontrolle der Translation zur Ausbildung von Krankheiten beiträgt. Nichtsdestotrotz gibt es bisher nur wenige Beweise für diese These. Obwohl vorherige Studien sowohl die direkten Ziel-RNAs von TDP-43 als auch dessen Funktionsweise in vielen Aspekten des RNA-Metabolismus aufdecken konnten, bleibt ungeklärt, welche Effekte auf die Genexpression die Hauptverursacher der genannten Krankheiten sein könnten.
Im Rahmen dieser Arbeit habe ich Ribosomales Profiling von moto- und kortikoneuronalen Zelllinien zwecks Identifizierung von mRNAs, deren Translation durch eine Patientenmutation in TDP-43 verändert ist, durchgeführt. Dadurch wurden eine Reihe translationaler Ziel-mRNAs identifiziert, einige davon in beiden der verwendeten Zelltypen. Darüber hinaus konnte eine erhöhte ribosomale Dichte für die mRNAs von Camta1, Mig12 und Dennd4a validiert und zugleich durch Crosslink-IPs gezeigen werden, dass diese mRNAs direkt von TDP-43 gebunden werden. Camta1 und Dennd4a mRNAs kodieren für Proteine, die direkt mit ALS und weiteren neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung stehen. Interessanterweise konnte ich zeigen, dass der Einfluss veränderter mRNA-Translation auf die daraus resultierenden Mengen der kodierten Proteine sowohl zelltyp- als auch zellkompartimentspezifisch sein kann. Desweiteren habe ich durch Luciferase- Messungen die Regionen der mRNA Sequenzen bestimmt, die die beobachteten positiven translationalen Regulierungen durch TDP-43 vermitteln. Diese waren im Fall der Camta1 und Mig12 mRNAs das 5’UTR und im Fall der Dennd4a mRNA das 3UTR. Diese Ergebnisse demonstrieren eine bisher nicht ausreichend wahrgenommene Rolle von TDP-43 als einen mRNA-spezifischen Enhancer und legen nahe, dass diese Funktion zur Ausbildung genannter Erkrankungen beiträgt.

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